人参β-AS基因RNAi表达载体工程菌的构建

利用重组PCR和酶切连接技术构建了人参β-香树素合成酶(β-AS)基因RNAi(RNAinterference,RNAi)植物表达载体,再经热转化法转化到发根农杆菌A4菌株中,得到含有人参β-AS基因RNAi植物表达载体的工程菌,为诱导转化人参外植体奠定了基础。

隐花色素CRY2基因片段克隆及RNAi植物表达载体的构建

隐花色素是植物向光反应的主要的光受体,介导蓝光/近紫外光调控的反应。在拟南芥中CRY2调节去黄化反应并控制开化时间。我们根据在GenBank中已经发表的拟南芥(NM_100320)、中国大白菜(AY176689)、油菜(AJ889779)CRY2基因的cDNA保守序列设计并合成同源引物。通过RT-PCR方法从"津田"芜菁(Brassica rapa L.subsp.rapa"Tsuda")总RNA中扩增出CRY2基因的cDNA部分片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR221中。测序表明,该片段与拟南芥具有87%的同源性,与油菜和中国大白菜的同源性达97%以上。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pH7GWIWG2(I)为基础,构建了由组成型启动子35S调控的CRY2基因的ihpRNAi植物表达载体。

多浆旱生植物霸王质膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因RNAi载体构建

以多浆旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)幼苗根系为材料,采用RT-PCR方法获得了其质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxSOS1的片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体PART27为基础,采用酶切连接的方法构建了CaMV 35S启动子驱动的含ZxSOS1基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体PARS,为利用RNAi技术深入研究ZxSOS1在霸王体内Na+转运中的功能及其在霸王适应干旱生境中的作用机制奠定基础。

苹果果实L-半乳糖脱氢酶cDNA的克隆及其RNAi载体的构建

【目的】从"皇家嘎拉"苹果幼果外果皮中克隆L-半乳糖脱氢酶(L-galactose dehydrogenase,GalDH)cDNA,进行生物信息学分析并构建其RNAi植物表达载体,为该基因功能鉴定奠定基础。【方法】应用同源序列克隆法克隆"皇家嘎拉"苹果GalDH基因,并进行生物信息学分析;利用噬菌体同源重组原理构建其RNAi植物表达载体pMDR-GalDH,并导入农杆菌EHA105。【结果】通过RT-PCR扩增得到1条约1.1 kb的条带,序列分析表明,该片段长为1 111 bp,包含一个975 bp的开放阅读框,可编码324个氨基酸残基,包含有醛酮还原酶的保守结构域和3个跨膜螺旋结构,其理论上的等电点pI为5.44,蛋白分子质量为34.99 ku;聚类分析显示,苹果GalDH核苷酸与已知其他植物GalDH核苷酸的相似性均在95%以上,判断其为苹果GalDH基因cDNA全长,命名为MdGal DH(GenBank登录号为:GQ131419)。另外,通过RT-PCR获得GalDH基因保守区段,成功构建了其RNAi植物表达载体pMDR-GalDH。【结论】从"皇家嘎拉"苹果中克隆了GalDHcDNA的编码区全长,并构建了该基因的RNAi植物表达载体。

野生罂粟BBE基因克隆及RNAi载体构建

以野生罂粟(Papaver somniferum)试管苗幼叶为材料,用Trizol试剂盆提取总RNA,通过RT-PCR法获得BBE基因的cDNA片段,序列分析表明,所获得的cDNA序列全长1 608 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),编码536个氨基酸,经blast检索该片段与GenBank中的小檗碱桥酶基因BBE(AF025430)同源性为94.84%.以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了CaMV-35S启动子驱动的含小檗碱桥酶基因片段反向重复序列的RNAi双元表达载体pARB,为培育低吗啡,高蒂巴因的罂粟新品系奠定了基础.

ZmPti1基因正义和RNAi表达载体的构建及其转化玉米的研究

构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178。收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株。并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论。

上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究

据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7株阳性植株。

中国水仙NtBCH基因的克隆及LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建

参考洋水仙BCH基因设计引物,以中国水仙花瓣cDNA为模板克隆出中国水仙NtBCH基因,全长959 bp,编码303个氨基酸。以中国水仙LCYE和BCH为目的基因,利用pKANNBIAL、pBI121和pCAMBIA1301等载体构建了LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体,为利用基因工程技术改良中国水仙奠定了基础。

人参3-O-UGT1基因RNAi表达载体工程菌的构建

人参3-O-UGT1基因(Pg3-O-UGT1)是控制人参中二醇型单体皂苷合成的关键酶基因,而二醇型皂苷和三醇型皂苷具有相反的药理活性。本文利用RT-PCR技术和酶切连接技术成功构建人参3-O-UGT1基因RNAi(RNA interference)植物表达载体,通过热转化法将重组表达载体转化进发根农杆菌A4中,得到含有人参3-O-UGT1基因RNAi植物表达载体的工程菌,为诱导人参外植体转化和人参皂苷合成机理奠定了基础。

芥菜型油菜BjuA03.TTG2基因启动子克隆及表达载体构建

为进一步分析芥菜型油菜BjuA03.TTG2启动子在调控该基因表达中的作用,本研究以含有该基因的BAC单克隆质粒DNA为模板,通过普通PCR获得BjuA03.TTG2上游1 839 bp的DNA序列。利用PlantCARE在线分析软件分析BjuA03.TTG2启动子序列,含有许多与应答相关的顺式作用元件,如激素、光、低温等。根据BjuA03.TTG2启动子顺式作用元件的位置设计引物,采用5’端系列缺失分析法,利用PCR方法对BjuA03.TTG2基因上游启动子序列进行特异扩增,分别克隆了1 839、1 497、1 165、863、627、377和297 bp的启动子片段并构建到pCAMBIA1304植物表达载体中。鉴定结果说明7个BjuA03.TTG2启动子不同区段与GUS融合的植物表达载体构建成功。研究结果为进一步分析BjuA03.TTG2启动子的功能作用提供前期基础。

植物RNA干扰表达载体构建方法的研究

从传统酶切—连接、同源重组、PCR技术为基础结合酶切—连接等方法,对近年来植物RNA干扰表达载体的最新构建方法进行综述。

高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建

【目的】利用载体重组技术分别将高山离子芥冷诱导基因(Cbcor15a)和报告基因eGFP插入载体pCambia1300-bar,并引入玉米泛素基因启动子UBi-1代替载体本身启动子CaMV35s,重组为适合甘蔗转基因的二元植物表达载体pCambia1300-cbcor15a-bar。【方法】参照pCambia1300-bar载体多克隆位点和基因Cbcor15a、eGFP和启动子UBi-1的核苷酸序列设计引物,通过载体重组技术将基因和启动子分别插入相应的位点。利用基因枪分别将pCambia1300-bar载体和重组载体导入洋葱表皮细胞,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察。【结果】与导入pCambia1300-bar载体的洋葱表皮细胞相比较,导入重组载体pCambia1300-cbcor15a-bar的洋葱表皮细胞内有强烈的绿色荧光信号。【结论】重组甘蔗转基因二元植物表达载体启动子Ubi-1能够调控下游冷诱导基因Cbcor15a和报告基因eGFP的正常高效表达,为外源基因Cbcor15a转化甘蔗提供保障。

法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及双元载体的构建

以留兰香(MenthaspicataL)为材料,利用RT PCR方法克隆法呢基焦磷酸合酶基因(fps)的cDNA,核酸序列分析表明,该基因的编码区长1050bp,编码349个氨基酸.进一步将fps基因插入植物表达载体BinAR,酶切鉴定及测序结果都证明fps的植物双元表达载体构建成功,为fps基因在烟草中的异源表达奠定了基础.

CBF1转录因子基因的克隆及两种启动子调控下的植物表达载体的构建

CBF1转录激活因子能调控一组抗干旱、抗低温基因的表达,更有效地提高植物抗干旱、抗低温的能力。现在国内外许多研究机构已经利用导入该转录因子来提高植物的抗寒性、抗旱性,并且获得一定的成功,但在园林植物上的应用还有待探讨。因此,本研究以拟南芥叶片为材料,通过PCR方法对其基因组DNA扩增,成功地克隆了逆境诱导型启动子和CBF1转录因子并分别构建了花椰菜花叶病毒CaMV35s启动子和rd29a启动子调控下的CBF1融合基因表达载体,为下一步转化园林植物,利用CBF1基因综合改良园林植物抗逆性及进一步探讨CBF1基因的抗逆分子机理奠定了物质基础。

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。

β-1,3-葡聚糖酶基因高效表达载体的构建及对小麦的转化

利用PCR方法设计引物 ,进行特异扩增 ,在得到的BG2基因片段的两端引入可以与表达载体多克隆位点相匹配的酶切位点 ,将该基因插入高效表达载体质粒pATC94 0中 ,获得表达质粒pATCBG2。通过基因枪转化法 ,将pATCBG2转化优质小麦品种龙辐麦 10、龙辐麦 3号 ,获得抗卡那霉素 (Kanamycin)的再生植株 ,经PCR ,PCR Southern和Dot blotting检测 ,结果表明 ,有 5个转基因植株在以上各项检测中全为阳性 ,证明目的基因已整合入这些转基因小麦基因组中。田间接菌发病检测结果表明 ,转基因植株比对照的抗病性提高 1～ 2级。

棉花GhDHAR3基因克隆、功能序列分析及烟草的遗传转化

对棉花EST数据库进行同源搜索、比对和序列拼接,经RT-PCR从陆地棉纤维组织中扩增得到脱氢抗坏血酸还原酶基因GhDHAR3的cDNA,其开放阅读框为792bp,编码由263个氨基酸组成的蛋白质。同源性比对分析显示GhDHAR3蛋白具有较高的保守性,进化树分析表明其与拟南芥AtDHAR3亲缘关系较近。利用软件进行蛋白质序列分析,GhDHAR3蛋白具有GST-N家族和GST-C-DHAR典型的结构域,分别属于硫氧还蛋白超家族和GST-C末端超家族。将GhDHAR3基因构建到植物真核表达载体pCAMBIA2300中,利用农杆菌通过叶盘法转化烟草,经PCR分子鉴定,获得了含GhDHAR3转基因烟草植株。首次克隆棉花DHAR基因,通过结构域分析其可能的作用并成功转化烟草。

香石竹ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

根据已发表的ACO核苷酸序列 ,设计一对引物 ,以香石竹品种‘American’基因组DNA为模板 ,扩增出香石竹ACC氧化酶基因 ,将其连接到pMD18加T质粒载体上 ,通过中间载体pBluescriptSK ,构建了ACO基因正向和反向插入的植物表达载体 ,并将其导入了农杆菌。酶切检测表明该片段已插入表达载体 ,序列测定结果显示所克隆基因片段含 3个外显子 ,2个内含子 ,其中

棉花GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一,参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)D5基因组数据库以AtMYB0(GL1,NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因GrMYB0,从徐州142中克隆了陆地棉的GhMYB0,其开放阅读框长度为843 bp,编码280个氨基酸。经过保守结构域分析和亚细胞定位确定GhMYB0为R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明,GhMYB0在徐州142开花当天开始高调表达,开花后20 d表达量达高峰;在所有的组织器官中,花中表达量最高,其次为胚珠。转基因功能分析结果表明,在野生型拟南芥(Columbia)中过表达GhMYB0,使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少;该基因在拟南芥突变体gl-1中过表达,能恢复表皮毛缺失型突变体的表型,说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用,本试验为研究R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。

人白介素-12植物表达载体的构建

目的构建人白介素-12(hIL-12)基因的植物表达载体.方法采用PCR技术从质粒pCA13-hIL-12中扩增hIL-12基因,SmaI,SacI分别酶切hIL-12基因和植物表达载体pBI121,回收,T4DNA连接酶连接得到重组质粒pBI121-hIL-12,双酶切和DNA测序鉴定后,通过三亲杂交法将表达载体pBI121-hIL-12分别导入根癌农杆菌EHA105和GV3101,用PCR法进行鉴定.结果双酶切及DNA序列测定证实hIL-12已插入到表达载体pBI121中,PCR扩增表明构建的重组表达载体pBI121-hIL-12成功转入根癌农杆菌EHA105和GV3101中.结论成功构建了植物表达载体pBI121-hIL-12,为进一步利用转基因植物生产hIL-12奠定了实验基础.