人CD40L真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞膜上的表达

目的:扩增人CD40L基因并在细胞膜上表达,建立一种不需蛋白纯化获得人CD40L的简单方法,为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用及机制奠定基础.方法:利用梯度RT-PCR从Jurkat细胞中扩增CD40L基因,测序证明序列正确后构建pcDNA3.1-40L真核表达载体,转染NIH3T3细胞,流式细胞仪检测目的基因的表达.结果:从Jurkat细胞内成功扩增人CD40L基因,筛选到一个序列无误的克隆;成功构建pcDNA3.1-40L真核表达载体;经转染NIH3T3细胞和G418初步筛选,流式细胞检测证明约41%的NIH3T3细胞膜上有CD40L基因表达.结论:利用RT-PCR技术可以从Jurkat细胞内扩增CD40L基因,利用pcDNA3.1表达载体可以实现人CD40L基因在NIH3T3细胞膜上的表达.

人CD40L在肿瘤细胞株中的表达

目的探讨重组表达载体pcDNA3.1(+)-CD40L在肿瘤细胞中的表达状况。方法将两种不同构型的pcDNA3.1(+)-CD40L重组载体以脂质体法分别转染于H446、H460及SK-hepⅠ细胞株,对三种转染细胞用PE标记的抗CD40L进行染色,采用流式细胞技术测试上述细胞中CD40L表达情况。结果 CD40L在SK-hepⅠ的表达,线型明显高于环型重组体;而在H446细胞,环型虽高于线型,但无统计学意义;三种细胞中CD40L的表达率,H446>SK-hepⅠ>H460,P<0.05。当对H460进行稳定转染时,其表达率明显增高。结论三种癌细胞被转染pcDNA3.1(+)-CD40L后,CD40L瞬时表达明显不同,主要与细胞代谢特点、吸收质粒颗粒的能力及增殖状态等生理因素密切相关。