两种方法介导外源基因稳定转染大鼠肝癌细胞株的有效性及其对细胞生长影响的比较

目的探讨磷酸钙共沉淀法与阳离子脂质体试剂形成复合物法两种基因转染方法构建大鼠肝癌细胞克隆株的有效性及对生长影响的比较。方法将携带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1分别用脂质体形成复合物法、磷酸钙共沉淀法导入大鼠肝癌CBRH-7919细胞,G418筛选基因稳定转染阳性单细胞克隆株。RT-PCR法检测EGFP基因在细胞中的表达。结果两种方法转染CBRH-7919细胞24h后,倒置相差荧光显微镜下观察均见绿色荧光。G418加压筛选14d后均形成阳性克隆,倒置相差荧光显微镜下可见绿色荧光,脂质体法的细胞克隆荧光强度强于磷酸钙。阳性克隆株经RT-PCR法检测,750bp于450bp处均有特异性条带。结论两种细胞转染方法均可使增强型绿色荧光蛋白基因稳定转染CBRH-7919,为今后探讨外源目的基因对靶细胞生长特性的影响奠定前期实验基础。

质粒表达载体转染HepG2.2.15和BEL-7402细胞的效率分析

目的:探讨pEGFP-N1质粒表达载体转染HepG2.2.15和BEL-7402两种肝癌细胞的效率。方法:提取、纯化pEGFP-N1质粒,采用脂质体将纯化的pEGFP-N1质粒转染HepG2.2.15和BEL-7402两种肝癌细胞。显微镜下观察细胞形态,分析转染效率。结果:HepG2.2.15细胞呈梭形或不规则三角形,可成层生长,有许多颗粒样物质和空泡。BEL-7402肝癌细胞呈梭形,相互拥挤呈现'铺路石'状。pEGFP-N1质粒转染HepG2.2.15细胞的转染率为27%,转染BEL-7402细胞的转染率为89%。结论:pEGFP-N1质粒转染BEL-7402细胞效率高于HepG2.2.15细胞。

Survivin启动子驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的了解Survivin启动子在HepG2肝癌细胞与3T3细胞中诱导Trail蛋白表达能力的差异,并评价其驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的能力。方法以pGL3-surp340质粒为模板,扩增Survivin340启动子,构建重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail。将重组质粒分别转染HepG2肝癌细胞和3T3细胞,通过Western Blot检测两种细胞中Trail蛋白表达的差异。利用流式细胞术检测HepG2肝癌细胞及3T3细胞转染重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail后细胞凋亡的情况。结果成功构建了重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail,转染HepG2和3T3两种细胞后,通过Western Blot检测,HepG2肝癌细胞Trail蛋白表达的相对灰度值为0.49±0.43,较3T3细胞Trail蛋白表达(0.15±0.37)明显增强(P<0.05)。利用流式细胞术检测,HepG2肝癌细胞转染重组质粒组的凋亡率(%)为11.59±0.74,空白质粒组为3.45±0.52,未转染组为2.67±0.34;3T3细胞重组质粒组的凋亡率(%)为3.26±0.24,空白质粒组3.16±0.15,未转染组2.83±0.27。HepG2细胞转染重组质粒组凋亡率明显高于其他对照组(P<0.05)。结论含Survivin基因启动子的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail在肿瘤细胞中能增强Trail蛋白的表达,并能诱导HepG2肝癌细胞凋亡。

P19细胞过表达外源Necdin对其细胞增殖的影响

构建PcDNA3.1/necdin真核表达载体并制备稳定过表达Necdin的P19细胞克隆,检测稳定过表达Necdin对P19细胞增殖的影响。从正常培养P19细胞提取RNA反转录成cDNA,以此作为PCR模板扩增得到necdin目的基因,插入PcDNA3.1载体的EcoRⅠ和XhoⅠ位点;脂质体法将构建的真核表达载体PcDNA3.1/necdin转染P19细胞,G418筛选后挑取细胞单克隆,Western印迹鉴定细胞单克隆中Necdin的表达水平。CCK-8法检测过表达necdin对P19细胞增殖的影响。成功构建PcDNA3.1/necdin真核表达载体并获得稳定高表达Necdin的P19细胞克隆,检测发现P19细胞过表达Necdin后其细胞增殖未发生明显变化。P19细胞稳定过表达外源Necdin对其细胞增殖无明显影响。

正交设计优化聚乙烯亚胺介导肝癌细胞基因转染效率的研究

研制无毒、高转染效率的聚乙烯亚胺(PEI)阳离子纳米粒,Zeta粒度仪、紫外可见光谱表征纳米粒,琼脂凝胶电泳阻滞实验分析报告基因质粒pEGFP-N1与PEI及聚乙二醇(PEG)修饰后PEI的复合能力及抗DNAseI酶降解能力,MTT检测纳米粒的细胞毒性,体外转染试验及流式细胞仪评价纳米粒的体外转染活性。以pEGFP-N1质粒与PEI阳离子纳米粒的电荷比(N/P)、PEG与PEI的接枝比例和质粒转染剂量为条件,转染效率为指标,正交设计法优化pEGFP-N1/PEI-PEG阳离子纳米粒介导的肝癌细胞基因转染效率。结果显示,PEG修饰后的PEI纳米粒对肝癌细胞毒性较小,粒径及电位较稳定,对质粒有较好的复合能力和抵制DNAseI酶降解能力;pEGFP-N1/PEI的N/P比为40∶1、基因质粒剂量为每孔6μg时,纳米粒复合物的转染效率最高为91%。PEG修饰后的PEI是一种高效、无毒的非病毒载体,能有效将基因转染入肝癌细胞,优化实验条件可提高转染效率。

泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白表达载体的构建及肝癌细胞中的表达

目的构建人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10荧光蛋白真核表达载体,并转染肝癌细胞,筛选建立稳定转染细胞株。方法从构建好的pMD19-T/UbcH10载体中PCR扩增UbcH10基因,PCR产物双酶切后克隆入pEGFP-N1真核表达载体中,构建真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10,进行双酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1利用脂质体Lip2000TM分别转染进入肝癌细胞SMMC7721中,建立肝癌细胞SMMC7721的G418细胞死亡曲线,选择G418的筛选浓度,经G418结合荧光显微镜观察筛选稳定转染细胞。将筛选获得的肝癌细胞进行有限稀释法单克隆化,收集单个细胞克隆扩大培养备用。结果经双酶切和测序鉴定,带有荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10构建成功,经脂质体介导真核表达载体pEGFP-N1/UbcH10和空载体pEGFP-N1成功转入肝癌细胞SMMC7721中,经800μg/mL G418筛选并进行单克隆化获得稳定转染的细胞株SMMC7721-pEGFP-N1和SMMC7721-pEGFP-N1/UbcH10,阳性转化率达到94%以上。结论人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10稳定高表达肝癌细胞株的建立,为该蛋白在肝癌发生发展过程中的具体作用机制的研究奠定了基础。