精子载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达

利用精子载体技术通过人工授精观察人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达。将含有人FⅧBD(B-domain deleted)cDNA的质粒pRC/RSV-hFⅧBD转染至小鼠精子,通过人工授精使母鼠受孕。新生小鼠出生后第4周,应用PCR筛查hFⅧBD cDNA阳性转基因幼鼠,取转有人FⅧBD cDNA幼鼠的血液检测血浆中的人FⅧ抗原和抗体,分别用Northern印迹和Western印迹检测脾、肝、肺和肾组织中人FⅧBD cDNA的转录和表达。结果发现,人工授精后20只受体母鼠7只受孕,共产下11只仔鼠,存活9只。PCR筛检出3只转有人FⅧBD cDNA的阳性鼠。3只阳性鼠血浆中的人FⅧ抗原量分别为8.65 ng/ml,7.84 ng/ml和8.44 ng/ml,人FⅧ的抗体均为阴性。Northern印迹和Western印迹检测显示3只F1代阳性幼鼠的脾、肝、肺和肾组织中均有人FⅧBD cDNA的转录和表达。结论提示,利用精子载体法可以制备转有人凝血因子Ⅷ基因的转基因小鼠,并表达人FⅧ蛋白,这为用精子载体技术生产转基因动物并将之作为生物反应器生产人凝血因子Ⅷ提供了实验依据。

新鲜冰冻血浆融化后凝血因子Ⅷ含量动态分析

目的探讨存放时间和存放温度对新鲜冰冻血浆(FFP)融化后凝血因子Ⅷ含量的影响。方法将24份血型为B型的新鲜冰冻血浆在37℃水浴箱中融化后,每袋均分成A、B袋,A袋存放在室温环境(25℃)中,B袋存放于4℃冷藏箱内,在0、15、30、45 min,1、3、4、24 h每袋各取样1次5 m L,立即用CA-1500血凝仪采用凝固法进行凝血因子Ⅷ定量检测。结果 FFP融化后凝血因子Ⅷ含量随存放时间延长而降低;同一时间点,4℃冷藏箱内存放的FFP其凝血因子Ⅷ含量衰变速度低于室温条件,且自45 min开始2袋衰变速度比较(P<0.05);同条件下凝血因子Ⅷ检测结果:1)室温中从30、45、60、180、240 min,24 h分别与0 min(即融化时)比较(P<0.05);2)4℃冷藏箱内,从1、3、4、24 h分别与0min比较(P<0.05);4 h室温保存下FFP所含凝血因子Ⅷ含量下降60%,4℃冷藏箱内FFP所含凝血因子Ⅷ含量下降40%。结论保存温度和保存时间直接影响新鲜冰冻血浆(FFP)融化后凝血因子Ⅷ含量,为保证凝血因子Ⅷ输注效果,临床上应在FFP融化后尽快输注。同样凝血因子Ⅷ含量监测试验中应尽可能在FFP融化后立即测试,融化后超过30 min测试,结果将出现显著性偏差。

蛋白C、蛋白S、FⅫ、FⅧ与静脉血栓栓塞的相关性研究

目的探讨蛋白C、蛋白S、凝血因子Ⅻ、凝血因子Ⅷ与静脉血栓栓塞的关系。方法以2012年8月至2014年9月我院收治的静脉血栓栓塞患者为实验组(66例),以同时期在我院体检的健康成人为对照组(66例),运用法国STA-R全自动凝血仪检测实验组和对照组血浆中的蛋白C、蛋白S、FⅫ和FⅧ的活性,采用利用t检验和χ2检验分析相关数据。结果与对照组相比,实验组中蛋白C和蛋白S的活性明显降低(P<0.05),而FⅫ和FⅧ的活性明显增高(P<0.05);实验组中FⅧ出现活性异常的比率为59.09%(39例),实验组中蛋白C、蛋白S、FⅫ和FⅧ活性出现异常的比率明显比对照组高(P<0.05)。结论蛋白C、蛋白S、FⅫ和FⅧ与静脉血栓栓塞关系密切,是静脉血栓栓塞形成的高危因素。

急性脑梗死患者蛋白C活性依赖凝固时间标准化比值降低

目的观察急性脑梗死患者蛋白C活性依赖凝固时间标准化比值(PCAT-NR)与相关凝血指标纤维蛋白原(Fib)、凝血因子Ⅶ活性(FⅦ:C)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)、抗凝血酶(AT)、D二聚体(DD)的相关性。方法经临床及影像学确诊急性脑梗死患者100例为病例组,选取75例体检健康者为健康人对照组,检测Fib、FⅦ:C、FⅧ:C、AT、PCAT-NR、DD并比较两组间差异;分析急性脑梗死患者PCAT-NR下降组与PCAT-NR正常组Fib、FⅦ:C、FⅧ:C、DD、AT结果差异;分析急性脑梗死患者PCAT-NR与其他凝血指标的相关性。结果急性脑梗死组Fib(3.38±1.25)g/L、FⅦ:C(130.5±15.9)%、FⅧ:C(135.8±43.1)%、DD(2.12±3.01)mg/L均高于健康人对照组,而AT(83.94±14.95)%、PCAT-NR(0.87±0.23)结果均低于健康人对照组,P均<0.05;急性脑梗死组患者PCAT-NR下降组Fib(4.03±1.25)g/L、FⅦ:C(138.2±6.9)%和FⅧ:C(151.5±54.9)%结果均高于正常组(P均<0.05),而DD、AT差异无统计学意义(P均>0.05);急性脑梗死患者PCAT-NR与Fib、FⅧ:C、DD呈负相关(r分别为-0.484、-0.356、-0.473,P均<0.05),与FⅦ:C、AT无相关性(P均>0.05)。结论急性脑梗死患者PCAT-NR水平下降与高凝状态有关,与Fib和凝血因子Ⅷ活性有一定关联。

两种方法制备冷沉淀凝血因子质量的比较

目的通过两种方法制备冷沉淀凝血因子的质量比较,选择合适制备冷沉淀凝血因子的方法。方法将2019年12月采集的96袋400 mL合格血液制备的新鲜冰冻血浆96袋,随机分为A、B两组,每组48袋。A组采用的方法为,将新鲜冰冻血浆先放到4℃血液保存冰箱融化5 h左右,再放入4℃数字控制水浴式血浆融化箱,继续水浴融化50 min左右,取出离心、分离、速冻;B组采用的方法为,将新鲜冰冻血浆放到4℃血液保存冰箱融化16 h左右取出直接离心、分离、速冻。对两组制备的冷沉淀凝血子质控检测结果进行对比。结果A、B两组制备冷沉淀凝血因子,其Ⅷ因子含量分别为(100.09±15.84)IU/袋、(102.02±19.15)IU/袋;纤维蛋白原含量分别为(233.93±53.61)mg/袋、(238.28±62.81)mg/袋,均达到GB18469-2012《全血及成分血质量要求》,差异无统计学意义(t=-0.529、-0.349,P>0.05)。结论两种方法制备冷沉淀凝血因子均符合国家标准,但将新鲜冰冻血浆放到4℃血液保存冰箱融化16 h左右取出直接离心、分离、速冻的方法制备冷沉淀凝血因子Ⅷ因子含量、纤维蛋白原含量略高,操作方法简单,效率更高,更适宜推广。

两种冷沉淀凝血因子制备方法的比较研究

目的分析不同仪器制备冷沉淀凝血因子的Ⅷ因子含量和纤维蛋白原含量。方法将来源于400 m L全血的新鲜冰冻血浆（FFP）随机分为2组,第1组使用CYTOTHERM-4T.6C低温融化箱制备,第2组使用ZBK-LCD-A1型冷沉淀制备仪制备,用血凝仪检测Ⅷ因子含量、纤维蛋白原含量,根据检测结果做统计学分析。结果 2组不同仪器制备的Ⅷ因子（FⅧ∶C）含量分别为（94.2±18.1）和（113.0±32.9）IU,纤维蛋白原（Fgb）含量分别为（218.1±39.3）和（230.9±34.1）mg;Ⅷ因子含量合格率分别为79.2%和100%,纤维蛋白原含量合格率分别为97.9%和93.8%。经统计学分析,2种仪器制备的Ⅷ因子含量及合格率有统计学差异,纤维蛋白原含量及合格率无统计学差异。结论 2种仪器制备的冷沉淀凝血因子均符合国家标准,ZBK-LCD-A1型冷沉淀凝血因子制备仪制备质量更优,效率更高。

离子色谱法测定人凝血因子Ⅷ中钙离子含量

目的建立测定人凝血因子Ⅷ中钙离子含量的离子色谱法。方法色谱柱为CS12A阳离子交换柱(250mm×4mm),淋洗液为0.025mol/L甲烷磺酸溶液,流速为1.0mL/min,柱温为35℃,进样量为25μL。结果钙离子质量浓度在0.5-2.5mmol/L范围内与峰面积线性关系良好(r=0.9998,n=5);检测限为0.0003mmol/L,定量限为0.0006mmol/L;精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2.0%(n=6);平均加样回收率为99.70%,RSD为0.76%(n=9)。结论该方法操作简便、专属性强、准确度高、稳定性好,可用于测定人凝血因子Ⅷ中钙离子的含量。

检测人凝血因子Ⅷ蛋白质含量的BCA法的优化及验证

目的优化检测人凝血因子Ⅷ(FⅧ)蛋白质含量的BCA法,并进行验证。方法对BCA法检测人FⅧ的蛋白质含量进行优化:模拟试管法进行化学反应,微量板法进行读数和计算;对优化后的BCA法的耐用性、标准曲线的线性和范围、准确性、重复性、中间精密性进行验证,并与传统的钨酸沉淀法、免疫散射比浊法和优化的凯氏定氮法的检测结果进行比较。结果 BCA法检测人血白蛋白(human serum albumin,HSA)蛋白质含量的可信区间为100～800μg/ml。甘氨酸和赖氨酸的浓度小于125 mmol/L时,对BCA法检测结果无干扰;以HSA作为标准品绘制的标准曲线的可信区间为62.5～1 000μg/ml,人FⅧ工艺样品在以HAS和BSA作为标准品绘制的两种标准曲线下的检测值差异无统计学意义(P>0.05);BCA法的准确性、重复性、中间精密性均符合验证要求;BCA法检测结果与优化后的凯氏定氮法相关性良好。结论优化了检测人FⅧ蛋白质含量的BCA方法,该法用于人FⅧ生产工艺中间品的质量控制是可行的。

逆转录病毒载体介导骨髓基质细胞体外表达人凝血因子Ⅷ

目的 探索骨髓基质细胞用于血友病A基因治疗的可能性。方法 采用一包含了B区缺失 (△ 76 0aa～ 16 39aa)的人凝血因子ⅧcDNA(FⅧ△BcDNA)的复制缺陷型重组逆转录病毒LNC FⅧ△B ,在低温 (32℃ )和离心等改进条件下转化体外分离培养的小鼠和兔骨髓基质细胞。分别采用一期法、ELISA法和半定量PCR方法检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性 (FⅧ :C)和抗原含量 (FⅧ :Ag)以及骨髓基质细胞的基因转化效率。并对转化细胞表达的FⅧ蛋白进行Westernblot分析。结果 与标准方法相比 ,离心和 32℃转化使小鼠骨髓基质细胞的基因转染效率提高 5 0 %～ 80 %。转化后的小鼠和兔骨髓基质细胞分泌的人FⅧ :Ag分别为每 2 4h(5 5 6± 80 )ng/ 10 6细胞和每 2 4h(4 80± 5 6 )ng/ 10 6细胞 ,FⅧ :C分别为每 2 4h 2 .42U/ 10 6细胞和 1.8U/ 10 6细胞。Westernblot分析显示 ,骨髓基质细胞分泌缺失B区的FⅧ蛋白 (FⅧ △ 760～ 163 9aa)与正常人血浆中的野生型FⅧ相似 ,主要以重 轻链异二聚体形式存在。结论 转化后的骨髓基质细胞可以高效分泌人FⅧ ,结合离心和低温对方法的改进 。

高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量

目的采用高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量。方法高效阴离子交换色谱法色谱条件：色谱柱：IonPacASll—HC离子交换柱（4mm×250mm）；流动相：20mmol／L的NaOH溶液，等度洗脱20min，流速：1．0ml／min；抑制器：ASRS4mm阴离子抑制器，抑制电流120mA；检测器：电导检测器，检测池温度30℃，进样量：25μl。对建立的方法进行线性范围、检测限的确定以及准确性、精密性验证，并进行初步应用。结果枸橼酸离子浓度在0．1～2．0μg／ml范围内，对照品色谱峰面积与枸橼酸离子浓度呈良好的线性关系，r=0．9990，按信噪比（S／N）为3确定方法的检测限为0．01μg／ml；准确性试验枸橼酸离子的总平均回收率为97．80％，RSD为0．69％；1份加样人凝血因子Ⅷ溶液连续测定6次峰面积的RSD为0．08％；高效阴离子交换色谱法、比色法及阳离子交换色谱法测定3批人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子含量的结果基本一致，均符合《中国药典》三部（2010版）规定。结论高效阴离子交换色谱法可用于测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量，且该方法操作简便、快速，准确性、精密性高。

丁酸钠诱导人凝血因子Ⅷ的体外表达

目的 观察丁酸钠对人凝血因子Ⅷ (hFⅧ )表达的作用 ,并初步探讨其机制。方法 采用B区缺失 (76 0～ 16 39氨基酸 )的hFⅧcDNA(BDD hFⅧcDNA)的重组质粒载体pRC/RSV BDD hFⅧ转化体外培养的小鼠NIH/ 3T3细胞 ,经丁酸钠作用后 ,分别采用一期法和ELISA法检测细胞培养上清中hFⅧ的活性 (hFⅧ∶C)和抗原含量 (hFⅧ∶Ag) ,并运用体外细胞核连缀反应技术 (Run onassay)观察丁酸钠对编码BDD hFⅧ全长、重链和轻链的cDNA转录的影响。结果 经丁酸钠诱导后 ,hFⅧ∶C和hFⅧ∶Ag较对照组提高了约 70 %。Run onassay显示丁酸钠通过增强BDD hFⅧ重链基因的转录进而增强BDD hFⅧcDNA全长的转录 ,因而提高hFⅧcDNA的表达水平。结论 丁酸钠通过增强编码hFⅧ重链cDNA的转录进而提高hFⅧ的表达水平 。

子痫前期重度患者FⅧ、FⅨ、AT-Ⅲ的测定分析

目的通过对子痫前期重度患者、正常妊娠妇女凝血功能及肝功能指标检测分析,探讨该疾病血管内皮细胞损伤、凝血系统激活及肝功能受损情况。方法通过使用凝固法,发色底物法,免疫法检测30例正常妊娠足月妇女、25例早发型重度子痫前期、35例晚发型重度子痫前期患者入院未用药前FVIII,FⅨ、AT-III,D-Dimer指标,并采用全自动生化分析仪测定其ALT、AST肝功能指标。结果早发型重度子痫前期组、晚发型重度子痫前期与正常对照组比AT-Ⅲ下降,FⅨ、D-D、ALT、AST升高,且差异具有统计学意义(P<0.01)。结论子痫前期重度尤其是早发型患者存在严重的血管内皮细胞损伤、血液高凝状态,随着病情的发展出现一定程度的肝功能损伤。

重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用。方法采用磁珠分离法提取样品中残留的CHO细胞DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行Q-PCR检测,根据标准曲线进行DNA残留量分析。对建立的方法进行专属性、准确性、重复性及中间精密度验证,并对重组人凝血因子Ⅷ原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果该方法 DNA浓度在0.003~300 pg/μL范围内,线性关系良好,R2为0.999,灵敏度可达0.003 pg/μL;对大肠埃希菌DNA无特异性扩增曲线,专属性良好;检测高、中、低浓度DNA加标量样品的回收率分别为82.68%、71.75%和72.67%,准确性良好;重复性检测的RSD为7.02%,中间精密度检测的RSD为9.31%,重复性及精密度良好。用该方法检测的3批重组人凝血因子Ⅷ原液的DNA残留量均远低于100 pg/剂量。结论成功建立了特异的CHO细胞DNA残留量的检测方法,该方法专属性好,准确性及精密度高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。

血友病A基因治疗的初步实验研究

目的 制备血友病A的治疗基因 ,从invivo途径观察人凝血因子Ⅷ (hFⅧ )在动物体内的表达。方法 将B区缺失 (76 0～ 16 39位氨基酸 )的hFⅧcDNA克隆至真核细胞表达载体pRC/RSV ,与转染试剂DOTAP Cholesterolliposome混合 ,制备治疗基因pRC/RSV hFⅧBD DOTAP Cholesterol。肌肉注射给BALB/c小鼠后 ,在第 2 ,10 ,2 0 ,30 ,40 ,5 0天取小鼠的血液以及心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌等组织。检测血浆中的hFⅧ抗原和抗体 ,用PCR和RT PCR方法检测hFⅧBDcDNA在小鼠各组织基因组中的分布及其转录情况 ,免疫组织化学染色检测各组织中hFⅧ的表达。结果 在注射结束后的第 48小时 ,小鼠血浆和组织中即有hFⅧ的表达 ,第 10天血浆中的hFⅧ抗原水平最高 ,达 17.5 5ng/ml,以后逐渐下降。血浆中的hFⅧ抗体在注射结束后的第 10天出现 ,以后缓慢升高 ,第 5 0天时达 37.0 6U/ml。PCR、RT PCR检测和免疫组织化学染色显示小鼠各组织中均有hFⅧBDcDNA的存在、转录和表达 ,但随着时间推移逐渐减少。脾、肺、肾脏中hFⅧBDcDNA的转录和表达时间均长于心脏、肝脏和骨骼肌。结论 由pRC/RSV hFⅧBD与DOTAP Cholesterolliposome结合而制备的治疗基因pRC/RSV hFⅧBD DOTAP Cholesterol能够通过invivo途径在动物体内很好地表达hFⅧ ,这为?

人博卡病毒荧光定量PCR方法(TaqMan探针法)的建立及其在血液制品污染情况调查中的应用

目的开发快捷方便的检测人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)方法,并调查华南地区血液制品和原料血浆中的污染情况。方法建立HBoV的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,并对相关血液制品企业提供的单人份血浆和原料血浆样品、人血白蛋白、静脉注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)、人纤维蛋白原、人凝血因子Ⅷ及人纤维蛋白胶-人纤维蛋白原中HBoV的污染情况进行检测。结果 HBoV-DNA在原料血浆和人凝血因子Ⅷ样本中的检测率分别为5.2%和5.0%,但在其他血液制品中则没有检出。结论本研究建立的基于TaqMan探针HBoV的实时荧光定量PCR方法可以很好地检测出原料血浆及血液制品中的HBoV,对于血液制品的病毒安全有重要意义。

重组凝血八因子及相关药物研究进展

从首个重组凝血八因子产品于1992年在美国上市以来,重组产品在血友病A的治疗领域取得了显著进展,在发达国家占据主要市场份额;随着对蛋白结构、功能和作用机理的深入研究,逐步改善重组蛋白的分子结构和生产工艺,在提高产品安全性的同时,满足患者用药的方便性和依从性。本篇综述概述了重组凝血八因子相关产品的分子结构和生产工艺。