钝齿棒杆菌CD945丙酮酸羧化酶基因的克隆、序列分析及表达

以钝齿棒杆菌 (Corynebacteriumcrenatum)突变株CD945的基因组为模板 ,运用PCR方法 ,扩增出丙酮酸羧化酶的基因片段。核苷酸序列分析结果表明 ,该片段全长 365 7bp ,以GTG为起始密码子 ,编码一个ORF。该ORF的核酸序列与Corynebacteriumglutamicum ,Mycobacteri umsmegmatis以及Saccharomycescerevisiae的丙酮酸羧化酶结构基因相比 ,相似性分别为98 2 2 %、62 41 %和 49 61 %。由ORF推导出的氨基酸序列与上述属种的丙酮酸羧化酶相比 ,同源性分别是 99 30 %、64 65 %和 44 0 4 %。经证实对于酶的催化活性至关重要的一些保守区域 ,如ATP和生物素的结合位点等 ,在该氨基酸序列中都存在。将该基因片段转化钝齿棒杆菌 (C .crenatum)CD945 ,利用CTAB处理细胞和苹果酸脱氢酶偶联测定相结合的方法 ,进行酶活力的分析 ,结果表明 ,重组子与供体菌相比 ,丙酮酸羧化酶的活力提高

质粒pXZ10145核苷酸序列测定和分析

以Sanger双脱氧中止法为原理,利用美国ABI公司370A自动核酸序列分析仪,我们测定了谷氨酸棒杆菌质粒pXZ10145全长4887bp的核苷酸序列,该质粒上存在包括ApaI等18种限制酶的单一切点,其它限制酶切点的数目和位置也被定出,质粒上有8个可能的阅读框架,通过序列分析,我们确定了pXZ10145断裂生成缺失突变体pNAT65的两侧位点,在两个断裂点上发现存在'ATCTAGC'7个碱基的同向重复序列。

钝齿棒杆菌天冬氨酸激酶基因的克隆和序列分析

运用PCR方法 ,从野生型钝齿棒杆菌株 (Corynebacteriumcrenatum)AS1 5 4 2及具有AEC抗性的突变株CD945染色体上分别扩增出天冬氨酸激酶 (AK)基因 (ask) ,构建了重组质粒。核苷酸序列分析表明 ,C .crenatumAS1 5 4 2AK基因与C .crenatumCD945相比 ,第 1 1 99位的碱基由T变为C ,引起酶蛋白β亚基第 80位氨基酸从亮氨酸变成脯氨酸。该氨基酸的突变在蛋白结构上位于ACT结构域内 ,该区受赖氨酸调控。C .crenatumAS1 5 4 2的AK基因的编码区核苷酸序列与C .glutamicum、C .flavum及B .lactofermentum相比 ,同源性分别为 97 2 3 %、97 5 5 %和 97 6 2 % ,酶蛋白氨基酸序列的同源性分别为 99 76 %、99 5 2 %和 99 76 %。但在AK基因的启动子上游序列部分与其它棒杆菌相比有较大差异。

谷氨酸棒状杆菌成分分析及其酸水解条件研究

对废弃的谷氨酸棒状杆菌成分进行分析,评估其作为培养基用有机氮添加物质的可能性。测定结果表明:谷氨酸棒状杆菌中粗蛋白含量74%,核酸含量6.53%,粗脂肪含量11.36%,灰分含量2.78%,营养成分比较丰富,具有较高的开发利用价值。通过正交实验得到酸水解谷氨酸棒状杆菌的最佳条件为:pH 0.5、水解温度115℃、菌体浓度15 g/100 mL、水解时间20 h。在上述条件下菌体蛋白水解度(DH)达到88.37%。

棒状杆菌条件致病菌临床感染及棒状杆菌的临床应用

棒状杆菌属除白喉棒状杆菌外,其他棒状杆菌一般认为是条件致病菌,寄生在人类口腔、鼻腔、咽喉部、外耳道、眼结膜、外阴和皮肤等处,可引起抵抗力低下的宿主发生各类感染。棒状杆菌属中的短小棒状杆菌是一种强有力的免疫激活剂,具有抑制肿瘤生长和转移的作用,在人肿瘤免疫治疗中,作为非特异性免疫激活剂被广泛研究和用于临床。

谷氨酸菌体蛋白的酶解条件优化

采用响应面法对谷氨酸菌体蛋白的酶解条件进行优化,以蛋白水解度为参考指标,确定最佳酶解工艺为酸性蛋白酶与β-葡聚糖酶的添加比例为3∶1,总加酶量为2%(相对于底物),pH值为4.0,水解温度50℃,底物浓度15%,水解时间10h,在上述条件下,蛋白水解度达到18.01%。

通过接合作用质粒从大肠杆菌到棒状杆菌的转移

构建了可接合转移的穿梭质粒pXZ911,pBZ51和pBZ52。这些质粒中含有具转移功能的Mob片段和在棒状杆菌中复制的复制区。以大肠杆菌S17—1为供体菌,通过接合转移作用,可将这些质粒转移到谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC21543、北京棒杆菌B3、北京棒杆菌1.299、裂氏棒杆菌B43、黄色短杆菌ATCC14067等棒状杆菌菌株,接合转移频率分别为:9×10^(-5),1×10^(-4),8.5×10^(-5),2.3×10^(-4),6×10^(-5),2.9×10^(-5)。本文还探索了大肠杆菌和几种革兰氏阳性棒状杆菌间基因转移的方法、转移频率、影响转移频率的因素、宿主范围等问题。

从白喉棒状杆菌PW8株中筛选高产毒株

Corynebacterium diphtheria PW8-weissensee was grown on different mediafor screening high toxin produce. Through six times of screening (selecting butyrousbrilliant smooth small colonies and teshng their toxin production capacity) fromoriginal strain producing toxin l60Lf/ ml, a high toxin- producing descendandculture was obtained, which produced 79% more toxin than the original strain did.

二氢吡啶二羧酸合成酶基因在棒杆菌中的克隆与表达

在棒杆菌中影响赖氨酸生物合成的关键酶之一是二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS),通过PCR扩增二氢吡啶二羧酸合成酶基因(dapA),将该基因连接于穿梭表达载体pLCX36的P32启动子下,得到重组质粒pLCXdapA,pLCXdapA以接合转移的方法转移到高丝氨酸营养缺陷型菌株谷氨酸棒杆菌A18中,获得dapA增强了的基因工程菌株。经摇瓶培养测定,编号为A18-21的结合子赖氨酸产量最高,达8.94mg/mL,是出发菌株的1.4倍。

T_(32)终止子在棒状杆菌基因表达中的功能

分别构建成两个克隆了邻苯二酚双加氧酶基因（xylE）的棒状杆菌—大肠杆菌穿梭表达质粒pJL13和pJL23.质粒pJL23中xylE基因下游带有pJL13中没有的T32终止子.比较两个质粒的邻苯二酚双加氧酶表达活性，发现T32可在棒状杆菌中有效地促进外源基因的表达.

PheAB基因在棒状杆菌染色体上的整合

改造大肠杆菌质粒ｐＬＣＸ３１，切除其中的ｘｙｌＥ基因得到大肠杆菌质粒ｐＪＬ０１．将源 于大肠杆菌的分枝酸变位酶－预苯酸脱水酶基因（ｐｈｅＡＢ）２．３ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ片段克隆到大肠杆 菌质粒 ｐＪＬ０１中启动子Ｐ３２的下游，构建成质粒ｐＪＬ０２．再在ｐＪＬ０２的ＨｉｎｄⅢ位点接入棒状 杆菌染色体的ＨｉｎｄⅢ消化的随机片段，构建成带不同棒状杆菌染色体片段而不带棒状杆菌 自主复制顺序的棒状杆菌整合质粒ｐＪＬ０３．通过接合转移将这些质粒导入苯丙氨酸生产菌黄 色短杆菌３６２１中，获得一系列整合菌株．发酵试验筛选到几株整合菌株，它们的Ｌ－苯丙氨酸 产量较出发菌株显著提高．稳定性试验表明，各整合菌株在无选择压力的液体培养基中连续 传代１０次，整合质粒稳定性仍在９５％以上．以ｐｈｅＡＢ作探针，与整合菌株染色体ＤＮＡ的 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子杂交试验证实ｐｈｅＡＢ基因整合在黄色短杆菌３６２１染色体上．