牛TARDBP基因核心启动子鉴定与转录调控分析

【目的】为了解牛TARDBP基因结构、功能及启动子活性区域,分析该基因的转录调控机制。【方法】通过PCR技术克隆牛TARDBP基因编码区全长序列。应用生物信息学软件对牛TARDBP蛋白性质和结构进行分析。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测TARDBP基因在泌乳期荷斯坦奶牛不同组织中的表达情况。应用5'RACE技术确定牛TARDBP基因的转录起始位点,PCR技术克隆牛TARDBP基因启动子区和5'端系列缺失片段,并运用生物信息学软件对牛TARDBP基因启动子区域CpG岛和潜在转录因子结合位点进行预测,双荧光素酶报告系统确定该基因的核心启动子区域。【结果】牛TARDBP基因在包括乳腺在内的多个组织中均有表达。TARDBP蛋白是一种水溶性非分泌蛋白,存在RNA识别结构域和DNA结合位点。TARDBP基因启动子区存在2个CpG岛和大量转录因子结合位点包括SP1、PPARA、PPARD、PPARG、SREBF1等。双荧光素酶活性分析结果显示牛TARDBP的核心启动子区位于-476--149之间,该区域包含Sp1、PPARG、PPARD、SREBF1结合元件,但不存在TATA-box。【结论】牛TARDBP基因在奶牛多个组织中均有表达。-476--149片段为牛TARDBP基因的核心启动子区,且该区域中存在与乳脂合成和分泌相关的转录因子结合位点。

丁酸钠在反刍动物上的应用研究进展

丁酸钠在反刍动物上具有促进瘤胃等消化道上皮细胞生长、缓解炎症、抗氧化等多种生物学作用,能够提高反刍动物的营养物质消化率、生产性能,以及抗球虫等。本文综述了丁酸钠的生物学作用及其在反刍动物上的应用研究进展,以期为丁酸钠在反刍动物上的应用提供理论和实践参考。

牛冻精改良技术的推广与应用

畜牧经济发展中,养牛业起到了重要的支撑带动作用。为推动畜牧业高质量发展,要高度重视畜牧良种繁育体系建设工作,加大对牛冻精改良技术的推广应用力度,通过引进优良牛品种冻精,经人工杂交后实现品种改良,可提升牛良种化程度,提高养牛科技含量,提高养殖经济效益。文章首先概述了牛冻精改良技术优势;其次分析了牛冻精改良技术应用要点;最后探讨了牛冻精改良技术推广措施。

一种腐熟促进剂配合微生物腐熟剂对鲜牛粪堆肥的效应研究

由于传统的堆肥方法存在体积大、发酵时间长、无害化程度和肥力低等缺点,使其在有机肥商品化生产上的利用受到明显限制。本文通过研究自主筛选的腐熟促进剂配合不同微生物堆肥腐熟剂对鲜牛粪堆肥的效应,探索有益微生物菌剂和腐熟促进剂在发酵过程中的作用,目的是加速堆肥进程使其资源化、无害化。结果表明,添加腐熟促进剂可以加速堆肥的发酵过程,提高堆肥产品的N含量。综合多个影响因子考虑,在鲜牛粪中添加该种堆肥腐熟促进剂,再接种微生物腐熟剂,有机物料升温快,腐熟好,既达到了高温堆肥的目的,又缩短了堆肥腐熟的时间,加快了鲜牛粪的无害化处理进程。本次试验还表明添加腐熟促进剂可显著降低重金属Cu、Zn的活性。

牛SRY蛋白表达纯化与体外功能鉴定

利用PCR技术从北京黑白花奶牛(Bostaurus)的基因组DNA中克隆了SRY(Sex-determiningregionontheYchromosome)基因编码区全长序列。序列分析表明牛SRY基因的HMG区(Highmobilitygroup)呈现高度的保守性,与人、小鼠、猪等的相似性达到70%。将SRY基因与pET-28a(+)载体相连,构建表达载体pET-28a/SRY;把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导30℃诱导4h,SRY蛋白可高效表达,表达产物占总蛋白量的26%。对表达产物进行了Western-blotting检测,并采用亲和层析技术获得了高纯度的牛SRY蛋白。通过PCR技术分别获得牛、人、鼠的苗勒氏管抑制物(MullerianInhibitingsubstances,MIS)启动子,凝胶阻滞试验证明,牛SRY蛋白可与人及牛的MIS启动子结合,但与鼠的Mis启动子不发生相互作用。

口服促孕散治疗前后持久黄体奶牛B超影像学的研究

为探讨促孕散治疗持久黄体的作用机理,本研究通过直肠检查结合B超直肠检查对持久黄体奶牛做出诊断后口服促孕散,应用B超每3d对黄体直径、卵泡数量、卵巢长度、卵巢宽度、子宫角纵径和子宫颈纵径进行测量,并统计1次,与用药前进行对比。30头持久黄体奶牛口服促孕散后,治疗有效头数25头,有效率为83.3%。停药后第1天卵巢出现小卵泡和中等卵泡,停药后分别在第10和19天大卵泡数量最多,部分奶牛出现发情并排卵,与用药前卵巢相比,结果发现左、右侧卵巢长在停药后均降低,但差异不显著(P>0.05);左、右卵巢宽在停药后均降低,但差异不显著(P>0.05);子宫颈纵径和子宫角纵径均在停药后升高,但差异不显著(P>0.05)。结果表明,B超是诊断奶牛持久黄体的有效手段,中药促孕散对持久黄体奶牛卵巢和子宫形态等指标具有一定的影响,可以促进黄体的溶解。

不同牛种CSN1S1基因启动子区SNP研究

为研究牛CSN1S1基因启动子多态性,选择产奶性能差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计1对引物分别扩增2个牛种CSN1S1基因5'调控区及第1外显子部分序列总长1035bp。结果表明:CSN1S1基因5'调控区存在3个新SNPs位点:G-531A、C-706T、T-761C,2个牛品种在各位点表现出不同多态性特征。生物信息学软件预测CSN1S1基因核心启动子区及转录因子结合位点,SNP位点造成核心启动子区2个重要转录因子结合位点消失,而产生3个新的转录因子结合位点。突变前后RNA二级结构有明显改变,目标序列未发现CpG岛。研究结果为进一步确定CSN1S1启动子功能奠定实验基础。

奶牛FcRn受体α链基因启动子区的SSCP多态性研究

以189头荷斯坦奶牛为研究对象,对FcRn受体α链基因(FCGRT)启动区采用PCR-SSCP方法进行多态性检测。结果表明,FCGRT基因启动区在P1、P2和P3引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性,位于引物P1扩增产物有AA、AB、BB3种基因型,其频率分别为25.40%、59.26%、15.34%;引物P2扩增产物有CC、CD、DD3种基因型,其频率分别为20.63%、56.61%、22.75%;引物P3扩增产物有EE、EF、FF3种基因型,其频率分别为1.59%、12.17%、86.24%。经克隆测序分析,在3个片段上分别发生了T→C、C→A、G→T的碱基序列突变。经χ2适合性检验,除SNP1外,荷斯坦奶牛在该基因位点上的SNP2和SNP3均处于Hardy-Weinberg平衡状态。

口服促孕散治疗奶牛卵巢静止的B超影像学研究

为探讨促孕散治疗卵巢静止的作用机理,本研究主要通过直肠检查结合B超对卵巢静止奶牛做出诊断后,对其口服促孕散进行治疗,应用B超对卵巢卵泡直径、卵巢长度、卵巢宽度、子宫角纵径和子宫颈纵径进行测量,并与用药前进行对比。30头卵巢静止奶牛口服促孕散后,治疗有效率达86.7%。停药后第1天卵巢出现中等卵泡和大卵泡,停药后第16天大卵泡数量最多,部分奶牛出现发情并排卵。与用药前卵巢比较发现,左右两侧卵巢长度在停药后第1、4、10、19天显著增大(P<0.05);左卵巢宽度在停药后第19天显著增大(P<0.05);右卵巢宽度在停药后第1、10、19天显著增大(P<0.05)。子宫颈纵径在停药后第13、16天极显著增大(P<0.01),第19天显著增大(P<0.05),子宫角纵径与用药前比较差异不显著(P>0.05)。结果表明,B超是诊断奶牛卵巢静止的有效手段,中药促孕散对卵巢静止奶牛卵巢和子宫形态学变化具有一定的作用,对治疗奶牛卵巢静止有明显的效果。

牛SOCS5基因5′调控区多态性研究

【目的】筛选SOCS5基因启动子区多态位点(SNP),并研究其对启动子功能元件的影响。【方法】选择贵州地方优良品种务川黑牛和中国荷斯坦奶牛两种生长性能差异明显的品种构建DNA池,直接测序后用DNASTAR软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS5基因多态性,然后用生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG岛,分析SNP位点对转录因子结合位点影响。【结果】牛SOCS5基因5'调控区和第1外显子区存在3个SNP位点,分别为:C-577T、T-43C和C+61T,其中C+61T与SNP数据库中的rs110977810信息相符,C-577T和T-43C为新发现SNP位点。生物信息学软件预测得到SOCS5基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生;SNP位点对转录因子结合位点有显著影响,但对核心启动子范围和起始位点无明显影响,不在甲基化水平上影响SOCS5基因表达水平。【结论】牛SOCS5基因5'调控区存在3个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点。

牛α-乳清蛋白基因5′调控区多态性研究

试验选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计1对引物分别扩增2个牛种α-乳清蛋白(alpha-lactalbumin,LALBA)基因5′调控区及第1外显子部分序列总长1126bp。结果表明,LALBA基因5′调控区存在5个SNPs位点:T-114C、C-166T、A-225C、C-344T、T-778C,T-114C仅在务川黑牛表现多态性。生物信息学软件预测LALBA基因核心启动子区及转录因子结合位点,SNP位点导致11个转录因子结合位点消失,其中1个位于核心启动子区,产生5个新的转录因子结合位点。突变前后RNA二级结构发生明显改变,目标序列未发现CpG岛。

促孕散治疗持久黄体奶牛血清白介素与激素的相关性分析

为探讨促孕散治疗持久黄体不孕奶牛血清生殖激素和白介素含量的关系,应用ELISA法测定了促孕散治疗持久黄体不孕奶牛前后血清中促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、孕激素(P4)、雌二醇(E2)、IL-1和IL-6的浓度,分析了4种激素和2种白介素间的相关关系与回归方程。结果表明,IL-1和IL-6水平与P呈负相关,与E2、FSH、LH呈正相关,结论:促孕散治疗持久黄体奶牛前后在血清中IL-1和IL-6的变化与生殖激素的分泌具有一定的相关性。

不同牛种SOCS6基因5′调控区多态性分析

为筛选SOCS6基因启动子区域单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)并研究其对启动子功能元件的影响,选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建DNA池,直接测序筛选SNP位点。结果表明,SOCS6基因5′调控区存在4个SNP位点,分别为T-513G、C-401T、A-332G和T-180G。生物信息学软件预测得到SOCS6基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近部分转录因子结合位点消失和新位点产生。多态性位点对转录因子结合位点有显著影响,但并不改变CpG岛大小。

牦牛与奶牛酪蛋白制备的CPPs分子量分布及其生物功能研究

牦牛或奶牛酪蛋白CPPs粗制品,经阴离子交换精制后获得的高磷组分具有相似的高效分子排阻层析(HPSEC)谱图,均分离出3个峰,分子量依次在15000￣16500u之间、4000￣5000u之间及2500u左右。采用体外消化模拟实验研究了CPPs样品的促钙吸收能力,证实牦牛与奶牛酪蛋白CPPs在促钙吸收能力方面无明显差异。探讨了CPPs制品的促钙吸收能力与r(N/P)、分子量大小分布之间的关系,结果表明:牦牛与奶牛酪蛋白CPPs的r(N/P)值越小其促钙吸收能力越强,而且分子量小于5000u组分在CPPs制品中所占百分率增加,则其r(N/P)呈下降趋势。

绵羊Oct4基因启动子序列的克隆及其与猪和牛序列的比较分析

为探明绵羊Oct4基因启动子的结构特点,用PCR方法克隆获得了绵羊Oct4基因启动子,并对绵羊、牛和猪Oct4基因的上游调控序列进行对比分析。结果显示,成功扩增获得长度为2 951 bp的绵羊Oct4基因启动子;绵羊、牛和猪Oct4基因的上游调控序列均含有4个保守区域(CR1–CR4),且4个保守区域在3个物种间具有高度同源性;CR1区域富含GC碱基对,且序列上的Sp1/Sp3位点与激素反应元件HRE在3个物种中具有100%的同源性;绵羊和牛、猪的上游调控序列富含GC,并存在大量的CCC(A/T)CCC位点。

不同来源β-酪蛋白基因启动子调控人IFNα-2b基因的表达效率

【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子,对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β-酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Genbank中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子序列进行比对分析,按照保守序列分别设计启动子区和3′端ploy A序列引物,同时设计人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液,提取基因组DNA。PCR克隆β-酪蛋白基因启动子区和3′端ploy A区,同时以实验室保存质粒为模板克隆人IFNα-2b基因和EGFP-Neo筛选序列。测序正确后,将各片段按设计顺序依次插入p MD18-T骨架中,构建成p HSTBCNp-IFN,p JSBCNp-IFN和p SNBCNp-IFN乳腺特异表达载体。将各载体转染Bcap-37细胞,经G418筛选出稳定整合的转基因细胞系。用胰岛素(1 mg·L-1),转铁蛋白因子(1 mg·L-1),氢化可的松(1 mg·L-1)和PRL(250IU·L-1)联合对转基因细胞系进行诱导,然后用PCR、Western blotting、QRT-PCR技术和ELISA方法分别在m RNA水平和蛋白质水平检测IFNα-2b的表达。【结果】PCR后获得了荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β-酪蛋白基因启动子区,长度分别为5 219、5 244和5 216 bp,其中包括了第一外显子,第一内含子和部分第二外显子,部分第二外显子的51个碱基编码17个氨基酸的信号肽序列。克隆了1 166 bp的ploy A区序列。最终将构建的3个乳腺特异表达载体转染Bcap-37细胞并经过G418筛选后,获得了3个转基因细胞系。经激素诱导后,PCR、Western blotting、QRT-PCR和ELISA检测发现3个转基因细胞系都表达了IFNα-2b基因,并且发现娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控IFNα-2b基因的表达上效率较高,在m RNA水平和蛋白质水平上显著高于其他两个启动子(P<0.05)。【结论】娟姗牛β-酪蛋白基因启动子在调控外源基因表达上具有较高的效率,是具有应用前景的乳腺特异性启动子。所构建的表达载体为IFNα-2b转基因动物乳腺生物反应器的制备奠定基础。

牛STAT1基因启动子区多态性研究

为筛选STAT1基因启动子区SNP及研究其对启动子功能元件的影响。选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,直接测序筛选SNP位点。结果表明:STAT1基因5'调控区及第1外显子存在3个SNPs位点,分别为:T-537G、T-508A、C+10T。生物信息学软件预测得到STAT1基因核心启动子区和转录因子结合位点,SNP位点导致1个转录因子结合位点消失,而产生10个新的转录因子结合位点。CpG岛范围未受到突变位点影响,但STAT1基因RNA二级结构在突变后显著改变。研究结果为进一步确定STAT1启动子功能奠定试验基础。

牛JAK2基因启动子区多态及生物信息学研究

为筛选JAK2基因启动子区SNP及研究其对启动子功能元件的影响,选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,直接测序筛选SNP位点。结果表明,JAK2基因5'调控区及第1外显子存在2个SNPs位点,分别为G+5A、G+104A。生物信息学软件预测得到JAK2基因核心启动子区,SNP位点导致9个转录因子结合位点消失,而产生1个新的转录因子结合位点。G+5A对转录因子结合位点、RNA二级结构和CpG岛均有显著影响。

牛尾部采血技术在西藏地区的应用

本文从牛尾部采血部位、采血过程、优点及注意事项四个方面进行详细的阐述,并提供临床实际操作的照片作为参考,以期该技术在西藏地区得到推广,为兽医工作者提供帮助。

三河牛β-乳球蛋白基因型及其启动子序列特点

[目的]分析三河牛β-乳球蛋白(β-Lg)的基因型,并探索其启动子序列与乳中含量的关系。[方法]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测乳中β-Lg遗传变异体及其相对表达量,并通过PCR扩增,比对不同遗传变异体启动子的序列差异。[结果]三河牛(n=62)乳清中β-Lg有AA、AB和BB共3种基因型,频率依次为0.290、0.403和0.307,A和B两种等位基因频率接近;对37个纯合型β-Lg启动子的部分序列进行PCR扩增(636 bp)和测序,并与普通牛β-Lg基因序列(GenBank登录号:U31361.1)比对,共检测到6个突变位点,其中-430、-362、-216和-204位点基本上是等位基因特异的,且有3个突变点在3种转录因子结合基序中;建立了三河牛乳中β-Lg含量的高效液相色谱测定方法,发现β-Lg含量在AA型中极显著高于AB型(P<0.01),但AA、AB型与BB型之间均无显著差异。[结论]三河牛β-Lg A和B两种等位基因频率接近,其启动子-430、-362、-216和-204位点具有等位基因特异性,并可能影响等位基因表达。