CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达

目的 :研究CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达。方法 :以质粒pBS176 1为模板扩增TAP -tag片段 ,PCR产物经纯化后克隆在真核表达载体pTRE2 -hyg上。再以pUK -CPSF 30k、73k、10 0k为模板扩增CPSF基因片段 ,将其克隆在质粒pTRE2 -hyg-TAP -tag中TAP -tag片段的下游 ,并将重组质粒转化入细胞株HelaTet -offS3细胞内。结果 :细胞抽提液经SDSPAGE电泳后进行蛋白质印迹杂交 ,胶片上出现野生型的CPSF条带和分子量较大的滞后条带。后者经分子量与分子标记对照 ,确系重组体TAP -tag-CPSF所表达的蛋白条带。结论 :重组质粒pTRE2hyg -TAP -tag-CPSF 30k ,73k ,10 0k在HelaTet -offS3内完好表达。

罗非鱼源无乳链球菌双重PCR快速检测方法的建立

根据GenBank中罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖的cpsF基因和CAMP因子的cfb基因序列,设计2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,并进行特异性试验、敏感性试验及人工感染罗非鱼组织样品检测,建立了快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。结果显示,仅无乳链球菌能扩增出cpsF和cfb两条特异性条带,而海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌无条带检出;经敏感性试验,最小模板检出量为7.632×10-2ng/μL;同时对30尾人工感染无乳链球菌的罗非鱼肝和肾组织中细菌DNA进行双重PCR检测和细菌分离鉴定,检出的阳性结果一致。证实,所建立的方法具有快速、特异、灵敏的优点,适用于对罗非鱼等无乳链球菌的感染病例进行流行病学监测。