脂质体介导的cripto反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞端粒酶活性

目的:探讨cripto反义寡核苷酸(ASODN)对结肠癌细胞端粒酶活性的影响。方法:应用脂质体瞬时转染法介导cripto反义寡核苷酸,处理人结肠癌细胞系后,分别采用实时定量PCR检测cripto mRNA表达,用TRAP检测端粒酶活性,采用软琼脂集落培养试验检测结肠癌细胞的生长。结果:Cripto ASODN可有效抑制结肠癌细胞集落生长,且与浓度相关。结肠癌细胞经Cripto ASODN转染后,端粒酶活性明显受到抑制,呈作用浓度和时间依赖性。并与ASODN的浓度和处理时间有关。结论:cripto基因可能参与对结肠癌细胞端粒酶活性的调控。

RNAi沉默Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的抑制

目的:研究Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的影响。方法:设计合成针对Cripto基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染结肠癌LS-174T细胞。细胞分4组:空载对照组(对照组)和不同浓度(3.125、6.25和12.5 nmol/L)的siRNA组。分别于转染24、48、72 h后收集细胞,以实时定量PCR检测结肠癌细胞CriptomRNA,分别采用Northern blotting和免疫荧光标记法检测癌细胞VEGF mRNA和蛋白表达。分别收集转染72 h的12.5 nmol/L组和对照组细胞,接种于裸鼠背部。30 d后处死裸鼠,收集裸鼠肿瘤组织,对组织VEGF进行免疫组化染色,计算染色平均强度。结果:实时定量PCR检测显示,转染组CriptomRNA被有效地抑制,且呈浓度和时间依赖性。转染组细胞VEGF蛋白和mRNA明显低于对照组。裸鼠肿瘤免疫组化分析显示,转染组VEGF平均染色强度明显低于对照组。结论:Cripto基因参与了结肠癌组织血管生成的调控。采用siRNA下调Cripto基因表达,可抑制结肠癌组织血管生成。

槲皮素对乳腺癌细胞侵袭及其cripto表达的影响

目的观察槲皮素(Que)对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,并探讨其可能机制。方法采用不同浓度的Que作用乳腺癌MDA-MB-468细胞,以软琼脂集落培养试验检测癌细胞集落形成数,以Boyden小室模型检测癌细胞侵袭力,分别以荧光实时定量RT-PCR和Western blot方法检测癌细胞cripto mRNA及其蛋白。结果经Que作用后,MDA-MB-468细胞恶性增殖和侵袭力均明显下降,且呈浓度依赖性(P均<0.05),其cripto mRNA和蛋白表达均明显下调,也呈时间和浓度依赖性(P均<0.05)。结论Que可明显抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞的侵袭力,其机制可能与下调该细胞cripto基因表达有关。

RNA干扰假基因Cripto-3表达对大肠癌细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨RNA干扰下调假基因Cripto-3(Cr-3)对人大肠癌细胞SW480增殖和侵袭的影响。方法:将大肠癌细胞随机分为5组:空白对照组,空载对照组,siRNA转染组(5 nmol/L组、10 nmol/L和20 nmol/L组)。将Cr-3小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人大肠癌SW480细胞后,采用实时荧光定量PCR检测Cr-3表达水平;分别采用平板克隆形成实验和Transwell法检测大肠癌细胞的增殖和侵袭能力。结果:与空白对照组和空载对照组比较,siRNA转染组Cr-3表达水平均明显下降,且呈浓度依赖性(P<0.05),癌细胞克隆形成和穿过滤膜的细胞均明显减少,且与浓度相关(P<0.05)。结论:假基因Cr-3在大肠癌细胞增殖侵袭中起着重要的作用,可能是大肠癌诊疗中的一个重要靶点。

Cripto-1基因沉默对人肝癌MHCC-97H细胞侵袭、迁移能力的影响

目的:探讨Cripto-1蛋白在人肝癌组织和肝癌细胞系中的表达,研究沉默Cripto-1基因后对肝癌细胞MHCC-97H侵袭和迁移能力的影响及可能的机制。方法:采用Western blot检测11对肝癌组织及相应的癌旁组织和不同肝癌细胞株中Cripto-1蛋白的表达;收集80例肝癌石蜡标本,免疫组织化学方法检测Cripto-1蛋白的表达情况;Cripto-1 siRNA转染肝癌细胞MHCC-97H细胞后,real-time PCR和Western blot分别检测转染效率;Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞的迁移和侵袭能力;Western blot分别检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白的表达。结果:Western blot检测结果显示肝癌组织中Cripto-1蛋白的表达明显高于对应的癌旁组织,Cripto-1蛋白在各肝癌细胞系中均有表达,且表达量高于对照细胞,其中高侵袭性肝癌细胞MHCC-97H表达量最高;免疫组织化学结果显示Cripto-1蛋白在88.7%的肝癌组织中表达;Cripto-1 siRNA转染MHCC-97H细胞后能显著降低Cripto-1mRNA和蛋白的表达水平,并且能降低其侵袭和迁移能力;Western blot结果表明,Cripto-1基因沉默后能抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达。结论:Cripto-1在肝细胞癌中的高表达可能与肝癌的发生发展密切相关,下调Cripto-1的表达可以抑制肝癌细胞侵袭和迁移能力,其机制可能与下调MMP-2、MMP-9的表达有关。

表没食子儿茶素没食子酸醋对人胃癌细胞迁移、侵袭和cripto蛋白表达的影响

目的观察表没食子儿茶素没食子酸醋(EGCG)对人胃癌细胞迁移、侵袭的影响,并探讨其可能机制。方法将人胃癌BGC823细胞分为两组,实验组加入20、40、80μmol/L的EGCG处理,以RPMI1640代替EGCG处理细胞作为空白对照组,采用划痕试验法检测癌细胞迁移能力,以Transwell法检测癌细胞侵袭能力,用免疫荧光方法检测癌细胞cripto基因蛋白水平变化。结果实验组细胞迁移距离、细胞穿过滤膜个数、cripto基因蛋白阳性率明显低于对照组,且均呈剂量依赖性,P均<0.05。结论 EGCG可明显抑制胃癌BGC823细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与下调cripto基因表达有关。

猪cripto促进C2C12细胞分化

应用分子生物学方法、荧光显微镜和实时荧光定量PCR技术，对cripto基因进行克隆、真核表达载体的构建，探讨cripto对C2C12细胞生长增殖的影响和肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG、P21、MHC的表达变化。结果显示，phiC31cripto真核表达载体构建成功，荧光显微镜下可见转染phiC31载体和（ripto基因共转染的C2C12细胞表达强烈的绿色荧光，且对细胞的生长增殖无显著性影响；Q_PCR检测MyoD、MyoG、P21、MHC结果证实，猪cripto可以促进细胞分化因子MyoD、MyoG、P21、MHC的表达。结果表明，本试验成功地构建了C2C12-phiC31fripto过表达细胞系，Q—PCR结果分析发现cripto基因可以促进肌肉分化，为进一步探索cripto基因在肌肉分化中的分子机制提供理论依据。