cya/crp基因缺失对鸡白痢沙门菌生物学特性影响的研究

为了解crp/cya基因对鸡白痢沙门菌毒力和生物学特性的影响,本研究构建缺失1182 bp cya基因的重组自杀性质粒pREΔcya,并经酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌χ7213作为供体菌,分别以鸡白痢沙门菌C79-13株和本研究室前期构建的其crp基因缺失株C79-13Δcrp(简写为Δcrp)为受体菌,利用重组自杀性质粒介导的同源重组技术构建C79-13菌株的单基因缺失株Δcya以及双基因缺失株ΔcrpΔcya,并均经PCR和测序鉴定。将这3株菌连续传60代后每隔10代分别利用PCR鉴定cya基因缺失的遗传稳定性;利用玻片凝集试验鉴定各菌株的血清型,并鉴定各菌株的生化反应特性;绘制各菌株的生长曲线分析缺失株与亲本株的生长特性;通过微量结晶紫法检测各菌株的生物被膜(BF)形成能力。PCR和测序鉴定结果显示Δcya、ΔcrpΔcya均正确构建,且cya基因缺失均具有稳定的遗传性。血清型及生化鉴定结果显示,菌株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya均保留了C79-13的O9血清型,而失去了发酵蔗糖、鼠李糖、葡萄糖、麦芽糖等糖类的能力。生长曲线及BF形成能力的检测结果显示,各缺失株的生长速度较亲本株相比均显著降低,尤其双基因缺失株ΔcrpΔcya的生长速度极显著下降(P<0.01),且基因缺失株BF的形成能力均极显著降低(P<0.01),其中双基因缺失株BF的形成能力更低。将3株缺失菌及亲本菌分别以不同的剂量(5×10^(8)cfu/只~7×10^(11)cfu/只)经腹腔注射感染雏鸡进行毒力试验,计算各菌株对雏鸡的半数致死量(LD_(50))。将各缺失株以10^(7) cfu/mL两次经灌服免疫雏鸡,100μL/只,二免后7 d各组雏鸡均以5.0×10^(8)cfu/mL经腹腔注射亲本菌株C79-13进行攻毒试验,500μL/只,在42 d的观察期内观察并记录各组鸡的发病及死亡情况,计算各基因缺失株对雏鸡的免疫保护率。结果显示,缺失株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya对雏鸡的LD_(50)分别为2.84×10^(9) cfu/mL、1.41×10^(10)cfu/mL、2.51×10^(11)cfu/mL,与亲本菌株C79-13相比,各缺失株LD_(50)分别升高约1.1×10^(3)倍、5.7×10^(3)倍、1.0×10^(5)倍;各组雏鸡攻毒后出现精神沉郁症状,且有部分鸡死亡,PBS对照组鸡出现排稀便症状,且全部死亡。Δcya、Δcrp及ΔcrpΔcya对雏鸡的免疫保护率分别为60%、80%、50%。表明各基因缺失株均能够对雏鸡提供一定的免疫保护效果,且单基因缺失株Δcrp的免疫效果最好。本研究首次对鸡白痢沙门菌crp、cya基因生物学功能做了初步研究,并证实缺失株Δcrp有望作为一种鸡白痢沙门菌基因缺失疫苗的候选菌株,为研制安全有效的沙门菌弱毒活疫苗奠定了基础。

鼠伤寒沙门氏菌SL1344株△crp△cya缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为研制更加安全并保持良好免疫原性的弱毒株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及疫苗活载体,本研究通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,将已缺失cya基因的SL1344株进一步缺失crp基因,构建S.typhi-murium SL1344△crp△cya双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pRE△crp的大肠杆菌χ7213为供体菌,SL1344△cya为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/cya基因双缺失突变株,并通过PCR和测序鉴定。对双缺失菌株的生物学特性鉴定表明,SL1344△crp△cya血清型与亲本株SL1344△cya及野生株SL1344保持一致,并且能够稳定遗传缺失后的crp基因;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化,生长速度也更为缓慢;对雏鸡致病性测定试验显示,双缺失株毒力比SL1344至少降低了约106倍。实验结果表明,S.typhimurium SL1344△crp△cya缺失株具有良好的遗传稳定性,毒力明显降低,为深入研究以S.typhimurium为载体的口服疫苗奠定了基础。

致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌cya、crp双基因缺失株构建及部分生物学特性分析

利用λ噬菌体Red同源重组系统构建致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌国内分离株G8107、G803、G8120和非致病性大肠杆菌J5的cya、crp基因缺失株,检测所得突变株的部分生物学特性,为大肠杆菌减毒活疫苗的研制提供新思路。首先,以pKD3质粒为模板扩增带有与目的基因(cya和crp)两侧序列同源的氯霉素抗性基因PCR片段;其次将PCR扩增产物电转化入含有pKD46质粒的野生型毒株感受态细胞中,获得目的基因被氯霉素抗性基因同源替换的缺失株;利用携带FLP位点特异性重组酶的温度敏感性质粒pCP20去除上述缺失株中的抗性基因标志,进一步结合PCR扩增和DNA测序,证明基因缺失株的正确构建,本试验成功构建上述各株大肠杆菌的△cya基因缺失株和△cyacrp双基因缺失株。生长试验、酵解试验以及毒力检验试验表明,相对于亲本株,上述缺失株生长速度减慢,分解利用糖的能力较差,对1日龄雏鸡的毒力显著降低,本试验结果初步证实所构建的缺失株可作为减毒疫苗候选株使用。

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。