快速有效的亚甲基蓝法检测肝素效价

通过实验分析亚甲基蓝与肝素的络合关系,讨论反应时间、溶液pH值、蛋白质的影响,建立一种快速、有效地检测肝素效价的方法。试验确定了分析波长为664 nm,且在0.09~0.54 IU/mL范围内的肝素与10 mg/L亚甲基蓝呈现良好的线性关系。反应时间在30~180 min范围内具有良好的稳定性;且该方法在pH=5~11范围内,1~30 mg/L牛血清蛋白(BSA)的干扰下仍保持较好的稳定性。对比实验中亚甲基蓝测肝素的方法与羊血浆法相差不大。该肝素检测方法简单、快速、经济、有效。

一种鉴别粗品肝素钠不同种属来源的简便方法

目的采用SAX-HPLC快速鉴别不同种属来源的粗品肝素钠。方法通过肝素酶酶解不同种属来源的粗品肝素钠,以其酶解后的二糖组份为考察对象,通过SAX HPLC法比较二糖的相对组成,鉴定种属来源。同时在猪来源肝素中分别添加不同比例(5%,10%,15%,20%,25%)的牛来源肝素或羊来源肝素,经肝素酶酶解后,通过SAX HPLC法鉴别在猪来源肝素中是否能快速检出不同种属来源的其他肝素。结果对于不同种属来源的粗品肝素钠,它们的二糖组成具有显著差异;若猪来源肝素混入5%羊来源肝素,即可通过其二糖组成判断。结论此法操作简便,成本较低,可用于不同种属来源的粗品肝素钠的定性检测。

荧光定量PCR测定粗品肝素钠DNA提取液中反刍基因及猪基因的浓度

采用细胞裂解和蛋白酶K消化技术,结合DNA制备柱选择性吸附DNA的方法提取粗品肝素钠中的动物DNA,将DNA标准溶液、粗品肝素钠DNA提取液分别与相应的PCR试剂混合,进行PCR扩增,测定粗品肝素钠DNA提取液中反刍基因及猪基因浓度。结果表明,反刍基因浓度在0.01~1000 pg·μL-1范围内线性关系良好,猪基因浓度在0.1~10000 pg·μL-1范围内线性关系良好。该方法具有良好的专属性、准确度、精密度,适用于粗品肝素钠动物来源的种属鉴别。

肝素样品前处理方法比较及荧光定量PCR法鉴定肝素原料种属来源

目的比较肝素原料的3种前处理方法,即磁珠吸附法、琼脂糖凝胶回收法和肝素酶降解法的优劣,并对肝素原料的种属来源进行鉴别。方法分别用磁珠提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和肝素酶对肝素原料进行前处理,用商业化的猪、牛、羊种属鉴别试剂盒进行检测。采用荧光定量PCR法对3批肝素原料进行种属来源的鉴别,同时对猪源肝素中掺入的不同比例羊源肝素进行检出限的检测。结果 3种不同的前处理方法以肝素酶降解法最快捷、最省时和最经济;种属来源鉴别结果准确。荧光定量PCR法检测猪源肝素中掺入羊源肝素的检出限是0.01%。结论肝素酶降解法能简捷、快速、经济的解决肝素原料中样品前处理的技术难点,结合商业化的猪、牛、羊鉴别试剂盒与荧光定量PCR仪能够简便、快速、准确的对肝素原料种属来源进行鉴别。

肝素钠的生产及其存在的问题和解决的方法(Ⅰ)——粗品肝素钠的生产工艺

本文论述粗品肝素钠生产工艺的各个环节、要点、注意事项、提高产品质量和收率的关键技术 ,并就目前厂家存在的常见问题进行了探讨 。

猪肺源肝素的分离纯化及其成分鉴定

本文报告了从猪肺中用改进后的碱性氯化钠盐解法萃取的粗肝素为原料，以新型分离材料ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ分离纯化，并与ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０进行比较，前者使粗肝素比活由１３．９ＵＳＰ／ｍｇ提高到２０３．６４ＵＳＰ／ｍｇ（美国药典单位），纯化系数达到１４．６５，回收率达８６．９３％，而通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０分离纯化后的肺肝素其比活性提高到１０２．１０ＵＳＰ／ｍｇ，纯化系数为７．３５，回收率为７２．２２％，其比活性、总活性回收率及纯化系数等，ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ均优于ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０。纯化相当量粗肝素所需时间、次数亦大大减少，并用醋酸纤维薄膜电泳，高效液相色谱进行性质和纯化鉴定，用红外光谱进行基团分析鉴定。

荧光定量PCR鉴定肝素粗品种属来源质控方法研究

研究了基于荧光定量PCR方法的肝素粗品种属来源质控方法,用于肝素药品生产企业的原料验收质量控制。该方法采用实时定量PCR法,针对猪、牛、绵羊、山羊基因组特有的基因序列设计引物与探针,采用聚合酶链式反应对目标基因进行扩增,利用扩增曲线的Ct值绘制标准曲线,通过未知样品的Ct值对未知样品初始模板中的基因进行定量。测定时通过肝素酶处理肝素原料,以消除肝素介导的PCR抑制效应。结果：该方法在本实验室条件下具有较好的专属性、准确度、精密度和耐用性：猪基因在30~0.06 ng/μL范围内呈良好线性,牛、绵羊、山羊基因在0.6~0.000 3 ng/μL范围内呈良好线性;猪基因的定量限为0.001 ng/μL,牛、绵羊、山羊基因的定量限为0.000 3 ng/μL。本质控方法较基因组纯化试剂盒提纯方法具有保证被检基因的真实性、原始性、完整性等优点。

β裂解法制备低分子肝素

目的以粗品肝素为原料,制备低分子肝素(LMWH)。方法采用β裂解法解聚粗品肝素,考察反应时间和加碱量,再通过VPOC1074、98CL两种大孔树脂进行分离纯化并比较效果。结果最佳反应及纯化条件为:采用β裂解法,加碱量为10%、反应90 min,再用VPOC1074大孔树脂分离纯化;制得的LMWH平均分子量为6.368 k D,抗凝活性为60.65 U·mg-1。结论所得LMWH的分子量满足《英国药典》总则的相关要求。