CryⅢA基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化

利用In-Fusion技术将酶切位点不匹配、目的基因内部含载体酶切位点的CryⅢA基因和植物表达载体pBI121相连接,分别成功构建了组成型启动子CaMV 35S和马铃薯茎叶特异表达启动子ST-LS1驱动的CryⅢA基因植物表达载体。利用冻融法将2个重组质粒转入根癌农杆菌LBA4404,转化马铃薯栽培品种陇薯3号和甘农薯2号获得了转化植株,经卡那霉素筛选和PCR检测,共有10株阳性植株CryⅢA基因成功整合到马铃薯基因组中。经实时荧光定量PCR检测表明,CryⅢA基因在CaMV 35S驱动的CryⅢA转基因植株的根、茎、叶中均有表达,且在叶中表达量较高,茎和根次之;在马铃薯茎叶特异表达启动子ST-LS1驱动的CryⅢA转基因植株中,在根中未见表达,仅在茎、叶中表达,且在叶中表达量较高。

抗天牛基因cryⅢA的改造及人工合成

采用中国林科院林业研究所生物技术室开发的核酸序列分析软件tRNASYSTEM分析了4000个杨树形成层基因氨基酸的三联体遗传密码,得出了一套适合于在杨树形成层高效表达的密码子,并通过该密码子,对从苏云金芽孢杆菌菌株Bt.886中克隆的、具有抗天牛作用的cry A基因进行了改造.在两端加上合适的酶切位点后,人工合成了最长为90bp的小片段,再经PCR延伸及T4连接酶拼接成全长为1812bp的基因.利用两端设计的酶切位点,将全长基因克隆到克隆载体PUC119上,为进一步用于在杨树形成层特异表达的研究打下了基础.