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人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定
被引量:
5
1
作者
徐重新
张存政
+3 位作者
张霄
刘媛
黄鹰
刘贤金
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第3期47-52,共6页
利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立...
利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对E.coli HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μg.mL-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μg.mL-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μg.mL-1,线性检测范围为0.5~5.0μg.mL-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在E.coliHB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在E.coli HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。
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关键词
Cry1B毒素蛋白
单链抗体
可溶性表达
抗原结合活性
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职称材料
苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究
被引量:
2
2
作者
董纯明
阮丽芳
+1 位作者
孙明
喻子牛
《应用与环境生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2007年第4期526-529,共4页
利用高温和SDS对苏云金素高产菌株CT-43-1c进行了质粒消除,筛选得到一株不产苏云金素的无晶体突变株BMB0806;并通过SDS-PAGE、高效液相色谱(HPLC)和脉冲电泳(PFGE)分析了野生型菌株CT-43、出发菌株CT-43-1c和突变株BMB0806杀虫晶体蛋白...
利用高温和SDS对苏云金素高产菌株CT-43-1c进行了质粒消除,筛选得到一株不产苏云金素的无晶体突变株BMB0806;并通过SDS-PAGE、高效液相色谱(HPLC)和脉冲电泳(PFGE)分析了野生型菌株CT-43、出发菌株CT-43-1c和突变株BMB0806杀虫晶体蛋白的组成、苏云金素的产量和质粒图谱之间的差异.结果表明,突变株BMB0806与菌株CT-43和CT-43-1c相比,分别缺失了3个和2个大质粒,从而不再产生苏云金素和由cry1B基因编码的分子量为140×103的杀虫晶体蛋白.进一步分析三者质粒图谱后发现,突变株BMB0806中苏云金素的缺失和cry1B基因所在的大质粒A直接相关.
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关键词
苏云金芽胞杆菌
苏云金素
质粒消除
cry1B
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职称材料
抗苏云金芽孢杆菌Cry1B毒蛋白质单链抗体的筛选与鉴定
被引量:
3
3
作者
徐重新
张霄
+3 位作者
刘媛
王耘
张存政
刘贤进
《江苏农业学报》
CSCD
北大核心
2012年第4期886-890,共5页
利用人源化噬菌体抗体库筛选抗Bt Cry1B毒蛋白质的单链抗体(Single-chain antibodies,scFv)。将扩增后的噬菌体抗体库与固相化包被的Cry1B毒蛋白质特异性结合,经4轮"吸附-洗脱-扩增"后,富集特异性识别Cry1B毒蛋白质的噬菌体...
利用人源化噬菌体抗体库筛选抗Bt Cry1B毒蛋白质的单链抗体(Single-chain antibodies,scFv)。将扩增后的噬菌体抗体库与固相化包被的Cry1B毒蛋白质特异性结合,经4轮"吸附-洗脱-扩增"后,富集特异性识别Cry1B毒蛋白质的噬菌体单链抗体。从最后一轮筛选中随机挑取单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得8个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。挑取阳性值最高的scFv(1E2)建立了基于单链抗体的Cry1B毒蛋白质间接竞争ELISA检测方法。结果表明,Cry1B毒蛋白质对噬菌体scFv(1E2)的抑制中浓度(IC50)为1.075μg/ml,最低检测限(IC10)为0.013 4μg/ml,线性检测范围在0.5μg/ml至4.0μg/ml之间。
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关键词
噬菌体抗体库
Cry1B毒蛋白质
单链抗体
ELISA
下载PDF
职称材料
题名
人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定
被引量:
5
1
作者
徐重新
张存政
张霄
刘媛
黄鹰
刘贤金
机构
江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室
南京师范大学生命科学学院/江苏省微生物与功能基因组学重点实验室
出处
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第3期47-52,共6页
基金
国家973计划项目(2012CB722505)
国家自然科学基金项目(31272109
31201535)
文摘
利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对E.coli HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μg.mL-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μg.mL-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μg.mL-1,线性检测范围为0.5~5.0μg.mL-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在E.coliHB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在E.coli HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。
关键词
Cry1B毒素蛋白
单链抗体
可溶性表达
抗原结合活性
Keywords
crylb
toxin
single chain variable fragments(scFv)
soluble expression
antigen binding activity
分类号
Q936 [生物学—微生物学]
下载PDF
职称材料
题名
苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究
被引量:
2
2
作者
董纯明
阮丽芳
孙明
喻子牛
机构
华中农业大学农业微生物学国家重点实验室/微生物农药国家工程研究中心
出处
《应用与环境生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2007年第4期526-529,共4页
基金
国家自然科学基金(No.30400003)~~
文摘
利用高温和SDS对苏云金素高产菌株CT-43-1c进行了质粒消除,筛选得到一株不产苏云金素的无晶体突变株BMB0806;并通过SDS-PAGE、高效液相色谱(HPLC)和脉冲电泳(PFGE)分析了野生型菌株CT-43、出发菌株CT-43-1c和突变株BMB0806杀虫晶体蛋白的组成、苏云金素的产量和质粒图谱之间的差异.结果表明,突变株BMB0806与菌株CT-43和CT-43-1c相比,分别缺失了3个和2个大质粒,从而不再产生苏云金素和由cry1B基因编码的分子量为140×103的杀虫晶体蛋白.进一步分析三者质粒图谱后发现,突变株BMB0806中苏云金素的缺失和cry1B基因所在的大质粒A直接相关.
关键词
苏云金芽胞杆菌
苏云金素
质粒消除
cry1B
Keywords
Bacillus thuringiensis
thuringiensin
plasmid curing
crylb
分类号
S476 [农业科学—农业昆虫与害虫防治]
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职称材料
题名
抗苏云金芽孢杆菌Cry1B毒蛋白质单链抗体的筛选与鉴定
被引量:
3
3
作者
徐重新
张霄
刘媛
王耘
张存政
刘贤进
机构
南京师范大学生命科学学院
江苏省食品质量安全重点实验室--省部共建国家重点实验室培育基地
南京农业大学植物保护学院
出处
《江苏农业学报》
CSCD
北大核心
2012年第4期886-890,共5页
基金
国家“973”计划项目(2012CB722505)
文摘
利用人源化噬菌体抗体库筛选抗Bt Cry1B毒蛋白质的单链抗体(Single-chain antibodies,scFv)。将扩增后的噬菌体抗体库与固相化包被的Cry1B毒蛋白质特异性结合,经4轮"吸附-洗脱-扩增"后,富集特异性识别Cry1B毒蛋白质的噬菌体单链抗体。从最后一轮筛选中随机挑取单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得8个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。挑取阳性值最高的scFv(1E2)建立了基于单链抗体的Cry1B毒蛋白质间接竞争ELISA检测方法。结果表明,Cry1B毒蛋白质对噬菌体scFv(1E2)的抑制中浓度(IC50)为1.075μg/ml,最低检测限(IC10)为0.013 4μg/ml,线性检测范围在0.5μg/ml至4.0μg/ml之间。
关键词
噬菌体抗体库
Cry1B毒蛋白质
单链抗体
ELISA
Keywords
phage antibody library
crylb
toxinprotein
single-chain antibody
ELISA
分类号
X836 [环境科学与工程—环境工程]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定
徐重新
张存政
张霄
刘媛
黄鹰
刘贤金
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013
5
下载PDF
职称材料
2
苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究
董纯明
阮丽芳
孙明
喻子牛
《应用与环境生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2007
2
下载PDF
职称材料
3
抗苏云金芽孢杆菌Cry1B毒蛋白质单链抗体的筛选与鉴定
徐重新
张霄
刘媛
王耘
张存政
刘贤进
《江苏农业学报》
CSCD
北大核心
2012
3
下载PDF
职称材料
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