干细胞样肝原始细胞的分离和鉴定

目的 :证实小鼠胎肝中肝干细胞的存在。方法 :小鼠胎肝细胞的分离培养和免疫细胞化学等。结果 :从小鼠胎肝组织中成功地分离得到了AFP、CD34及Albumin等特异性分子标记阳性、并呈集落样生长的细胞系。结论 :小鼠胎肝中存在具有干细胞特性的原始细胞 。

人胎肝干细胞的体外培养及诱导分化

为体外分离培养和诱导分化人胎肝干细胞 ,从原代分离培养人胎肝干细胞集落 ,免疫细胞化学鉴定细胞集落分子标志物的表达 ;在体外特定细胞因子作用下诱导干细胞定向分化为成熟肝脏细胞 ,对其生物学特性进行初步鉴定。结果 ,从人胎肝组织中成功分离表达AFP、Albumin、Cytokeratin等标志物的胎肝干细胞集落 ,在体外特定细胞因子作用下肝干细胞可定向分化为成熟肝脏细胞。因此人胎肝中同样存在具有干细胞特性的原始细胞 ,体外可定向分化为成熟肝细胞。

人胎肝基质细胞培养上清液中造血生长因子的分析

采用人胎肝造血基质细胞的体外液体培养技术,结合造血干细胞和祖细胞的体外测试方法,研究了造血基质细胞所释放的造血生长因子与造血干细胞和祖细胞之间的相互作用。结果表明,在适宜的条件下,人胎肝造血基质细胞可在体外传代培养达100d之久。培养过程中,对不同时间收集的培养上清液进行测试的结果表明,这些贴壁细胞可以不断地释放多种造血活性物质。在100d培养过程中,上清液中始终都可以检出CFU-S增殖刺激物活性。培养第24天的上清液中还可检出BPF和GM-CSF活性。这些造血活性物质对CFU-S的生理状态和祖细胞的增殖与分化有着深刻的影响。但是在培养上清液中未检出IL-3样活性物质。

低能量激光对人胎肝造血细胞的增殖作用

低能量激光对生物体具有刺激作用。经Ar^+激光波长514.5nm照射后的人胎肝造血细胞,可以在体外培养体系中分裂增殖,造血细胞集落明显增多。用激光照射产生集落刺激因子(CSF)的细胞,可以提高CSF的活性,在造血细胞体外培养体系中,使用该CSF,也能明显地提高造血细胞集落的形成率。用激光技术来处理造血细胞,可以成倍地提高细胞产率。这一技术不仅有理论意义而且有实用价值。

胎肝源性细胞促进人骨髓间充质干细胞向肝细胞的定向分化

目的：探讨人胎肝源性细胞（HFLC）对骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化为肝系细胞的效应和机制。方法：药物流产的胎肝源性细胞和Hoechst33342标记的人MSCs，按培养方式不同，分为HFLC和MSCs直接接触共培养组及transwell共培养组，用倒置显微镜观察细胞形态，在不同时段用免疫细胞荧光法检测肝系细胞标志如AFP、CK-18和CK-19并进行糖原染色。结果：在直接接触共培养组，免疫细胞荧光法显示分化细胞表达AFP、CK-18和CK-19，并随分化时间延长表达量增加；同时，分化细胞具有贮存糖原功能，PAS染色显示分化细胞糖原染色阳性。而在transwell共培养组，分化细胞未检测到肝系细胞标志物的表达及糖原的贮存。结论：HFLC与MSCs的直接接触共培养体系的微环境，有利于MSCs定向分化为肝系细胞。

大鼠胎肝前体细胞的分离培养

目的 探索胚龄 (ED) 13 5d大鼠胚胎肝脏中肝前体细胞的生物学特性 ,为细胞移植及基因导向治疗奠定基础。方法 酶消化法分离肝前体细胞 ,观察不同体外培养对肝前体细胞生物学功能的影响 ,并用免疫组化方法鉴定分离培养细胞的分化标志。结果 肝前体细胞在原代胚胎成纤维细胞饲养层 (PREF)培养 ,其增殖能力较无饲养层培养强 ,原代培养可保持未分化状态。细胞分化标志鉴定提示ED13 5d大鼠胚肝前体细胞中存在双分化能力的细胞。结论 ED13 5d大鼠胚肝前体细胞存在双分化能力的原始肝细胞 ,肝前体细胞可在PREF进行体外扩增。

具有双向分化潜能的鼠胎肝干细胞的分离、培养及鉴定

目的优化体外分离、培养和筛选胎鼠肝脏干细胞（LSC）的方法,并鉴定其双向分化的潜能。方法通过密度梯度离心和细胞差异性贴壁法分离小鼠胎肝干细胞（FLSC）,以细胞平板克隆技术和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定FLSC的增殖,通过添加二甲基亚砜（DMSO）和HGF等诱导干细胞分化。结果分离后的FLSC 24h内贴壁,卵圆形,排列紧密,1~2周内活化,CD133、CD49f、EPCAM的阳性率分别为（97.95±1.21）%、（92.71±3.49）%、和（50.73±3.45）%,表达甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白19（CK19）;诱导分化后糖原染色（PAS）法染色可见红色糖原颗粒,表达清蛋白（ALB）、肝细胞核因子4α（HNF-4α）。结论联合密度梯度离心和差异性贴壁法成功分离FLSC,分离后的FLSC干性强,增殖能力强,具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力。

高效液相色谱法定量分析人胎肝细胞上清液及细胞裂解液中7-酮基胆固醇

用高效液相色谱法定量分析了７－酮基胆固醇在胎肝细胞上清液及细胞裂解液中的含量。色谱柱为μ－ＰｏｒａｓｉｌＳｉＯ２柱，流动相为正己烷∶异丙醇（９１∶９，Ｖ／Ｖ）。方法回收率高、色谱重复性好。

胎肝细胞培养上清液对小鼠急性肝衰竭的保护作用

为探讨胎肝细胞治疗重型肝炎的机制,将84只小鼠随机分为3组(每组28只),经D-氨基半乳糖/内毒素(D-galn/LPS)诱导急性肝衰竭后,分别给予生理盐水(NS)、RPMI1640培养液(RPMI)和人胎肝细胞培养上清液(FHCS)治疗,各组分别取14、8、6只小鼠进行存活率、血清谷丙酶(ALT)及肝脏病理观察。结果显示,NS组和RPMI组24小时存活率分别为14.3％和21.4％;ALT升高达207.2±41.3IU/L和188.4±52.6IU/L。FHCS组小鼠存活率为57.1％,ALT为92.5±28.7IU/L,与对照组相比差异显著(P<0.05,P<0.01)。此外,对照组分别有5(83.3％)只和4(66.7％)只动物肝组织病理改变在Ⅲ级以上,而FHCS组仅有2(33.3％)只。上述结果表明,FHCS对急性肝衰竭有保护作用,同时提示胎肝细胞分泌产物可能与保护肝细胞、治疗重型肝炎及肝衰竭的机制有关。

体外培养的胎肝细胞半同系移植效果的研究

以Dexter体系成功地建立了小鼠胎肝细胞体外长期培养技术。培养的胎肝造血干细胞(CFU-S)有旺盛的增殖力。半同系移植研究证实,5×10~6个培养细胞(含780～1200CFU-S)可使9.5Gy γ-线照射的受体小鼠30d和60d存活率达80％和74％。1个月造血功能恢复。无移植物抗宿主病(GVHD)征象,并在受体内形成了稳定的嵌合体。说明体外培养的胎肝细胞能有效地重建造血。观察小鼠移植后14.5个月的远期疗效,其造血机能健全,体内CFU-S的移植效力与正常相似。然而CFU-S的再生速率和自我更新力均较正常同龄鼠低,揭示出长期增殖状态的造血干细胞功能上的变化。

BMSC-肝细胞共培养上清治疗大鼠急性肝衰竭疗效观察

目的探讨骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stemcells,BMSC)-肝细胞共培养上清治疗大鼠急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)的疗效,为其临床应用提供实验依据。方法分别利用肝细胞、BMSC、BMSC-肝细胞培养上清治疗腹腔注射D-氨基半乳糖胺(D-gal)诱导的大鼠ALF模型,观察各治疗组动物的1周存活率,肝功能和肝组织病理改变。结果肝细胞、BMSC及两者共培养上清治疗组大鼠存活率显著高于对照组(P<0.01),其中共培养上清治疗组大鼠存活率最高达80%;各治疗组ALT、AST、TBIL较治疗前均显著降低(P<0.01),共培养上清治疗组下降最明显;各治疗组肝脏病理组织学损害明显减轻,对照组损害加重。结论 BMSC-肝细胞共培养上清能更有效的救治大鼠ALF模型,有望为ALF的治疗提供了新的治疗途径。

小鼠CFU-GEMM性能的研究

本文对小鼠多能造血祖细胞(CFU-GEMM)进行了集落细胞组成、克隆线性关系、细胞周期活动及再植能力的观察;并在胎肝体外长期培养中观察了其数量的动态变化。发现:CFU-GEMM具有一定的增殖和自我更新能力,可多向分化,其中的细胞多数处于相对静止状态,是一群性能非常接近于CFU-S的多能祖细胞。胎肝体外长期培养中,CFU-GEMM与CFU-S数量的动态变化趋势也是一致的。这一结果表明:在人类及其它大动物目前还不能测定CFU-S的情况下,CFU-GEMM是一类可以反映造血干细胞池性能及动态变化的细胞。

小鼠胎肝细胞透明质酸3D培养体系的建立

为了利用透明质酸建立小鼠胎肝细胞3D培养体系,分离获得胚胎12~14d胎肝细胞,利用KM培养基进行初步2D肝干/祖细胞的筛选培养,并利用透明质酸及KM培养基配制水凝胶建立3D细胞培养体系.胎肝细胞在2D体系中呈现克隆状生长.分离培养获得的肝干/祖细胞,克隆在透明质酸建立的3D培养体系保持增殖活性,并进一步获得肝细胞功能特性,表现为3D培养上清中白蛋白合成和尿素水平显著增加.定量PCR结果显示,随着3D培养时间的延长,其肝细胞干性标志如AFP、CK19、Ep CAM、Prox1等表达水平都大幅度降低且接近成年小鼠肝脏表达水平.本研究成功建立基于透明质酸的小鼠胎肝细胞的3D无血清培养体系,并可促进小鼠胎肝细胞的肝细胞功能进一步成熟.

糖尿病小鼠来源的骨髓间充质干细胞培养上清液诱发胰岛素抵抗的研究

目的探究糖尿病小鼠来源的骨髓间充质干细胞及其旁分泌作用在诱发胰岛素抵抗(IR)中扮演的角色。方法建立小鼠糖尿病模型,提取并培养骨髓间充质干细胞(BMSC),收集培养上清液(M-BMSC-CS)。(1)细胞实验:将HepG2肝细胞分为正常低糖培养组[用低糖DMEM(5.55 mmol·L^(-1))进行培养]、M-BMSC-CS实验组(M-BMSC-CS 75μL)、高糖高脂对照组(给予25 mmol·L^(-1)高糖DMEM+0.25 mmol·L^(-1)棕榈酸)。(2)动物实验:小鼠分为正常小鼠组(腹腔注射等体积0.9%NaCl)和M-BMSC-CS-m组(M-BMSC-CS通过腹腔注射给予正常小鼠,注射剂量0.2 mL/10 g)。用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖摄取量,用免疫荧光法检测Glut2蛋白荧光强度,用蛋白质印迹法检测胰岛素信号通路蛋白表达;检测口服葡萄糖耐量(OGTT)和胰岛素耐量(ITT)。结果正常低糖培养组、M-BMSC-CS实验组和高糖高脂对照组的葡萄糖摄取量分别为(2.96±0.05)、(1.64±0.28)和(1.42±0.32)mmol·L^(-1),葡萄糖转运蛋白2(Glut2)荧光表达分别为53.21±2.70、30.95±3.39和34.96±7.60,磷酸化胰岛素受体底物1-ser307(p-IRS-1ser307)表达蛋白相对水平分别为0.46±0.21、1.09±0.24和0.91±0.16,磷酸化蛋白激酶(p-AKT)蛋白相对表达水平分别为0.94±0.05、0.59±0.06和0.53±0.05,Glut2蛋白表达水平分别为1.08±0.14、0.58±0.14和0.62±0.09;M-BMSC-CS实验组的上述指标与正常低糖培养组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常小鼠组和M-BMSC-CS-m组空腹血糖分别为(5.23±0.57)和(9.30±1.14)mmol·L^(-1),p-AKT蛋白相对表达水平分别为1.27±0.21和0.51±0.19,Glut2蛋白相对表达水平分别为1.17±0.17和0.79±0.09;M-BMSC-CS-m组的上述各指标与正常小鼠组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论糖尿病小鼠来源的BMSC培养上清液在体外引起正常HepG2肝细胞胰岛素抵抗,在体内诱发正常小鼠胰岛素抵抗。

CN2006型生物人工支持装置恒温培养系统对胎肝细胞活性的影响

目的观察细胞活性,客观评价CN2006型生物人工肝支持装置恒温培养箱控制系统,为生物人工肝的临床应用提供依据。方法选择16周正常引产的人胎肝,胎肝组织采用两步灌流法进行消化分离。在培养条件为37℃、5%CO2、湿度100%下培养24 h后,倒置相差显微镜观察细胞的生长及形态变化;用MTT法检测细胞活力,以2×105/ml细胞数在酶标仪上所测吸光度作为对照;同时,检测胎肝细胞清除氨的能力,设无胎肝细胞的反应器为空白对照。结果胎肝细胞培养24 h后,在倒置相差显微镜下观察发现细胞呈集落状生长。在装置内反应器中培养24 h后,胎肝细胞在装置的反应器中生长良好,而且得到了增殖。细胞在装置内反应器中培养24 h后,加入氯化铵溶液,通过在不同时间检测氨的浓度表明在装置内反应器中培养的肝细胞具有生物转化功能。结论细胞在CN2006型生物人工肝支持装置中不仅生长良好,而且还具有生物转化功能,说明设计的恒温培养系统适宜细胞生长环境,为生物人工肝的临床治疗提供了坚实的理论基础。