鼠伤寒沙门氏菌SL1344株△crp△cya缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为研制更加安全并保持良好免疫原性的弱毒株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及疫苗活载体,本研究通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,将已缺失cya基因的SL1344株进一步缺失crp基因,构建S.typhi-murium SL1344△crp△cya双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pRE△crp的大肠杆菌χ7213为供体菌,SL1344△cya为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/cya基因双缺失突变株,并通过PCR和测序鉴定。对双缺失菌株的生物学特性鉴定表明,SL1344△crp△cya血清型与亲本株SL1344△cya及野生株SL1344保持一致,并且能够稳定遗传缺失后的crp基因;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化,生长速度也更为缓慢;对雏鸡致病性测定试验显示,双缺失株毒力比SL1344至少降低了约106倍。实验结果表明,S.typhimurium SL1344△crp△cya缺失株具有良好的遗传稳定性,毒力明显降低,为深入研究以S.typhimurium为载体的口服疫苗奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株cya基因缺失株生物学特性的检测

目的:探索鼠伤寒沙门菌cya(adenylate cyclase,cya)基因的功能及其缺失株减毒的初步机制。方法:对鼠伤寒沙门菌SL1344株cya基因缺失株的耐酸碱能力、耐盐性、运动性、生物被膜成分、对上皮细胞黏附、侵袭以及细胞毒性等生物学特性进行检测。结果:cya缺失株的耐酸碱性、耐盐性以及运动能力较亲本菌株有明显降低;生物被膜成分测定结果显示cya缺失株不表达纤维素和菌毛;同时与亲本菌株相比cya缺失株对上皮细胞的黏附和侵袭能力发生了显著的降低,且对细胞毒性的影响弱于亲本菌株。结论:上述结果表明cya基因功能与细菌的运动能力、细胞膜的渗透能力、生物被膜的形成及毒力密切相关,从而为鼠伤寒沙门菌cya基因功能及其缺失株减毒机制的进一步研究提供了理论参考,这也必将有助于研发以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗。

致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌cya、crp双基因缺失株构建及部分生物学特性分析

利用λ噬菌体Red同源重组系统构建致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌国内分离株G8107、G803、G8120和非致病性大肠杆菌J5的cya、crp基因缺失株,检测所得突变株的部分生物学特性,为大肠杆菌减毒活疫苗的研制提供新思路。首先,以pKD3质粒为模板扩增带有与目的基因(cya和crp)两侧序列同源的氯霉素抗性基因PCR片段;其次将PCR扩增产物电转化入含有pKD46质粒的野生型毒株感受态细胞中,获得目的基因被氯霉素抗性基因同源替换的缺失株;利用携带FLP位点特异性重组酶的温度敏感性质粒pCP20去除上述缺失株中的抗性基因标志,进一步结合PCR扩增和DNA测序,证明基因缺失株的正确构建,本试验成功构建上述各株大肠杆菌的△cya基因缺失株和△cyacrp双基因缺失株。生长试验、酵解试验以及毒力检验试验表明,相对于亲本株,上述缺失株生长速度减慢,分解利用糖的能力较差,对1日龄雏鸡的毒力显著降低,本试验结果初步证实所构建的缺失株可作为减毒疫苗候选株使用。