Cyclin G2抑制胃癌细胞增殖的实验研究

目的研究cyclinG2对体外培养胃癌细胞增殖能力的影响,探讨cyclinG2作为肿瘤干扰阻断药靶的有效性和临床使用性。方法应用脂质体转染技术将包含有cyclinG2cDNA的pIRES-G2和对照空质粒pIRES-neo分别转染胃癌细胞株SGC-7901,经G418(400μg/mL)选择性培养基筛选两周后获得转入cyclinG2基因的细胞克隆,通过细胞化学法和免疫蛋白印迹杂交检测外源性cyclinG2蛋白表达情况;倒置显微镜下观察克隆细胞形态,Giemsa染色后进行克隆计数。结果转染pIRES-G2获得的细胞克隆中cyclinG2蛋白的表达水平明显高于转染pIRESneo,表明cyclinG2基因被成功地转入SGC-7901细胞稳定表达;转染pIRES-G2组的阳性细胞集落数目明显减少,pIRESneo组的集落数为(87±3),pIRES-G2组的集落数为(53±4),占对照组的60.1%(P<0.01);与对照组相比,pIRES-G2组集落内细胞数目减少,细胞皱缩,形态变得不规则,胞质内出现大量颗粒和空泡。结论cyclinG2可显著抑制体外培养胃癌细胞的增殖,并可能和肿瘤细胞信号传导系统存在某种联系。

Cyclin G2抑制肿瘤细胞增殖的研究

背景与目的:周期蛋白(cyclin)是调节细胞周期活动的重要蛋白质,是细胞增殖的正调节因子。CyclinG2可能不同于其它周期蛋白,其表达可被DNA损伤和抑癌基因VHL诱导,对细胞增殖可能起负性调节作用。此外,我们在对口腔鳞癌进行基因表达谱研究时发现,癌组织中cyclinG2表达降低。本研究的目的是为了弄清cyclinG2表达究竟是促进还是抑制肿瘤细胞体外增殖。方法:应用RT-PCR扩增获得cyclinG2基因cDNA,将其插入到真核表达载体pIRESneo的BamHI和BstXI酶切位点处,获得重组表达质粒,命名为pIRES-G2。通过脂质体介导将pIRES-G2转染肿瘤细胞系HeLa,经G418筛选2周,观察细胞集落形成情况并计数形成的集落数。结果:实验组集落的数量显著少于对照组,而且所形成的集落大小也明显比对照组小,细胞皱缩、形态不规则,胞质内颗粒增多、出现空泡。pIRESneo空载体对照组的集落数为76.7±24.8;实验组的集落数为18±10.4,占对照组的23.4%。结论:CyclinG2基因高表达对HeLa细胞的体外增殖和生长有显著抑制作用。

cyclin G2荧光蛋白重组质粒的构建及其对宫颈癌HeLa细胞的作用

目的构建包含人cyclin G2基因的荧光蛋白重组质粒,探讨cyclin G2对宫颈癌He-La细胞凋亡的影响。方法运用RT-PCR和基因克隆技术构建pDsRed2-Cyclin G2重组质粒;脂质体法转染重组质粒至HeLa细胞中,荧光显微镜下观察其蛋白的表达和定位;流式细胞术检测HeLa细胞的凋亡率。结果成功地构建了pDsRed2-Cyclin G2荧光蛋白重组质粒,其融合蛋白在HeLa细胞中的定位为弥漫分布在细胞核和细胞质。转染重组质粒能够促进HeLa细胞的凋亡。结论外源性cy-clin G2转染至HeLa细胞中可促进其凋亡,抑制细胞增殖。

斑节对虾cyclin G2基因克隆及不同刺激下的表达分析

细胞周期蛋白G2(cyclin G2)是细胞周期中的重要调控因子。该研究初步探讨斑节对虾(Penaeus monodon)细胞周期蛋白G2(Pmcyclin G2)在卵巢发育中的作用,利用RACE技术克隆获得4075bp Pmcyclin G2 c DNA全长,其开放阅读框(ORF)1161bp,编码386个氨基酸。利用荧光定量PCR技术研究了Pmcyclin G2组织表达模式,结果显示,Pmcyclin G2在斑节对虾的心脏、血淋巴、肝胰腺、卵巢等组织中均有表达,其中肌肉中表达量最高;卵巢发育不同阶段Pmcyclin G2的表达分析则表明,Pmcyclin G2在III期表达量最高;注射5-羟色胺(5-HT)能诱导卵巢Pmcyclin G2基因表达升高,多巴胺(DA)则抑制卵巢中Pmcyclin G2基因表达。利用原核表达技术获得了cyclin G2的体外重组蛋白,Western Blot分析证实重组蛋白为cyclin G2蛋白。此结果为进一步研究该蛋白的功能提供了条件。以上研究结果表明,Pmcyclin G2基因可能与斑节对虾卵母细胞发育有密切关系,该结果可为进一步探究斑节对虾卵巢的发育机理提供理论依据。

cyclin G2在乳腺病变组织中表达及其对MCF-7细胞的作用

目的研究细胞周期蛋白G2(cyclin G2)在乳腺病变中的表达及意义,探讨cyclin G2对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法用免疫组化SP法检测cyclin G2在人乳腺不同病变中的蛋白表达,并进行显微图像分析;利用阳离子介导的脂质体法转染pDsRed2-cyclin G2融合基因至人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中,流式细胞术检测MCF-7细胞的凋亡率。结果 (1)cyclinG2在乳腺增生症中的阳性表达率及表达强度与正常乳腺组织相当,而在导管原位癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)以及浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)中表达逐渐下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)转染了重组质粒pDsRed2-cyc-lin G2的MCF-7细胞凋亡率明显增高(P<0.01)。结论 cyclin G2蛋白表达随着乳腺疾病恶性程度增加而降低,外源性转染cyclin G2至MCF-7细胞中可促进其凋亡,抑制细胞增殖。

周期素Cyclin G2在小鼠睾丸生精上皮中的表达特点

目的:观察细胞周期素Cyclin G2在不同发育期小鼠睾丸生精上皮细胞中的表达特点,初步探讨其在精子发生过程中的生理意义。方法:分别选取3周龄、5周龄、7周龄、12月龄雄性昆明小鼠睾丸组织,运用免疫组化方法观察分析Cyclin G2在小鼠生精上皮中的表达。结果:Cyclin G2在3周龄小鼠生精上皮中表达低(%Area=15.238);在5周龄小鼠生精上皮中,Cyclin G2表达增加(%Area=41.344),并且定位于胞质;在7周龄小鼠生精上皮中,Cyclin G2进一步增加(%Area=50.102),并在生精上皮末端为甚,在曲细精管中部形成一条鲜明的棕色深染条带;12月龄小鼠生精上皮中,Cyclin G2回到较低水平(%Area=30.994),但仍高于3周龄。以上结果进行t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结论:Cyclin G2在生精上皮中的表达特点提示其与精子发生相关,可能参与了生精过程停止和减数分裂过程的调控。

cyclin G1，G2蛋白表达与卵巢浆液性囊腺癌的相关性研究

目的探讨cyclin G1,G2蛋白表达与卵巢浆液性囊腺癌发生、发展的关系。方法应用免疫组化(S-P)方法,对32例卵巢浆液性囊腺癌和26例卵巢浆液性囊腺瘤的cyclin G1,G2蛋白表达进行检测。结果32例卵巢浆液性囊腺癌和卵巢浆液性囊腺瘤组织中cyclin G1蛋白表达阳性百分比分别为84.37%和30.77%,cyclin G2分别为21.88%和61.54%,差异均具有统计学意义(P<0.01)。cyclin G1蛋白在卵巢浆液性囊腺癌中表达增高,cyclinG2蛋白在卵巢浆液性囊腺癌中表达减低。结论cyclin G1,G2蛋白表达改变可能与卵巢浆液性囊腺癌的发生机制有关。

Cyclin G2与LDHA相互作用的鉴定分析

目的分析细胞周期素G2(cyclin G2)与乳酸脱氢酶A(LDHA)之间的相互作用及其意义。方法将LDHA全长cDNA片段分别克隆到pGEX-5X-1和p3×FLAG-CMV-14载体上,构建pGEX-LDHA原核重组蛋白表达载体和p3×FLAG-CMV-LDHA真核重组蛋白表达载体,诱导表达并纯化GST-LDHA融合蛋白,通过GST pull-down及western blot技术分析cyclin G2与LDHA的相互作用。分别转染p3×FLAG-CMV-LDHA、pEGFP-FALGCCNG2质粒到HEK293细胞使其表达,利用带有抗FLAG蛋白标签抗体的免疫沉淀凝胶进行Co-IP实验,进一步验证cyclin G2与LDHA的相互作用。结果成功构建了pGEX-LDHA原核重组蛋白表达载体和p3×FLAG-CMVLDHA真核重组蛋白表达载体。GST pull-down实验证实了cyclin G2与LDHA在细胞外的相互作用。Co-IP实验证实了cyclin G2和LDHA在细胞内的相互作用。结论 cyclin G2与LDHA在细胞内和细胞外能发生相互作用,为研究cyclin G2生物学功能奠定实验基础。

cyclin G1、G2蛋白表达与喉癌的相关性研究

目的总结分析原发性喉鳞状细胞癌及其相邻正常黏膜组织新鲜标本中cyclinG1、G2蛋白表达与喉癌的组织病理分级、临床分期以及解剖分型的关系，以探讨cyclinG1、G2蛋白表达与喉癌的可能相关性。方法回顾性分析52例喉癌（喉癌组）及其相邻正常黏膜组织标本（手术切缘癌旁1．0cm外黏膜组织，对照组）的临床病理资料，52例喉癌组织标本经病理切片确诊。所有患者术前均未行放疗和化疗，均无远隔器官转移。术后病理TNM分期：Ⅰ期8例（T1N0M0），Ⅱ期12例（T2N0M0），Ⅲ期24例（T3N0M06例，T3N1M08例，T2N1M010例），Ⅳ期8例（34N0M01例，T4N0M0l例，T3N2M03例，T2N0M03例）。病理分级：G1高分化鳞癌21例，G2中分化鳞癌18例，C3低分化鳞癌13例。声门型28例，声门上型24例，无声门下型病例。采用免疫组化（SP）法检测组织中cyclinG1、G2蛋白表达。结果cyclinG1蛋白表达阳性部位位于细胞核，而cyclinG2位于细胞质中。喉癌及其相邻正常黏膜组织中cyclinG1蛋白表达阳性百分比分别为82．69％（43／52）和30．77％（16／52），cyclinG2分别为21．15％（11／52）和61．54％（32／52）。与相邻正常黏膜组织比较，cyclinG1蛋白在喉癌中表达增高，而cyclinG2蛋白表达降低，差异均具有统计学意义（P〈0．01）。喉癌的组织病理分化越低、临床分期越高，cyclinG1蛋白表达增高越明显，cyclinG2蛋白表达降低越明显。cyclinG1、cyclinG2蛋白表达与喉癌的解剖分型无相关性。结论喉癌中cyclinG1蛋白表达增高，cyclinG2蛋白表达降低，提示其可能与喉癌的发生、发展机制有关。cyclinG1、G2蛋白的检测可望成为判断喉癌预后的指标之一。

细胞周期蛋白G2 mRNA在急性白血病患者中的表达及临床意义

为了探讨急性白血病(AL)患者中细胞周期蛋白G2(cyclin G2)的mRNA表达及其临床意义,采用逆转录 聚合酶链反应(RT-PCR)法检测74例急性白血病患者及10例正常人骨髓细胞中的cyclin G2、G1和P53的mRNA 表达,对cyclin G2的阳性扩增产物进行序列分析。结果表明:①AL患者中cyclin G2的阳性率及mRNA表达水平 (52.7％,0.552±0.498)明显低于正常人(100％,1.953±0.675)(P<0.01)。②在初治的AL患者中,cyclin G2 阳性表达患者的完全缓解(CR)率高于阴性者(分别为69.2％和40％;P<0.05)。③耐药组AL患者cyclin G2的 阳性率(43.6％)明显低于敏感组(68.6％)(P<0.05)。④对初治28例CR的AL患者进行随访14.3个月(11- 18.5个月),11例cyclin G2低表达患者中有10例复发(90.9％),而17例cyclin G2高表达患者中有7例复发 (41.2％),两者之间有显著性差异(P<0.05)。结论:CyclinG2是影响AL患者CR的因素,其高表达可能是AL患 者良好预后的指标之一。

细胞周期蛋白G2在甲状腺癌组织中表达及其对癌细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨细胞周期蛋白G2(cyclin G2,CCNG2)在甲状腺癌组织中表达的意义及其过量表达对甲状腺癌SW579细胞增殖、凋亡的影响。方法:收集唐山市工人医院头颈科2003-2008年手术切除的63例甲状腺癌标本及其癌旁组织,免疫组织化学方法、Western blotting检测其中CCNG2蛋白的表达情况,分析CCNG2蛋白表达与临床病理指标、患者生存期之间的关系。通过慢病毒转染方法建立过表达CCNG2的甲状腺癌SW579细胞,采用RT-PCR及Western blotting检测转染后SW579细胞内CCNG2基因的表达水平,MTT比色法及流式细胞术观察CCNG2过表达对SW579细胞增殖、凋亡的影响。结果:CCNG2蛋白在甲状腺癌组织中的表达阳性率(33.3%vs 96.8%,P<0.05)及相对表达量(0.343±0.033 vs 0.713±0.062,P<0.05)均显著低于癌旁组织;CCNG2蛋白表达在甲状腺癌患者不同性别、年龄、肿瘤大小组间无显著差异(均P>0.05),而在不同的甲状腺癌细胞分化程度、淋巴结转移以及肿瘤临床分期组间有显著差异(均P<0.05);CCNG2表达阳性的甲状腺癌患者的5年总生存率明显高于其表达阴性者(P<0.05)。成功构建CCNG2过表达的SW579细胞,CCNG2过表达能明显抑制SW579细胞增殖能力,促进肿瘤细胞凋亡[(15.1±2.3)%vs(5.6±1.1)%,P<0.05]。结论:CCNG2在甲状腺癌组织中低表达,CCNG2过表达能够抑制甲状腺癌SW579细胞的增殖并促进其凋亡。

人细胞周期蛋白G2基因真核表达载体构建及其功能研究

构建人cyclinG2基因真核表达载体,进一步研究cyclinG2对体外培养细胞增殖的调节作用及可能的调节机制。以人口腔癌前上皮细胞系POE4总RNA的反转录产物为模板,应用RT-PCR方法克隆cyclinG2基因cDNA,成功构建了真核表达载体pIRES-G2。应用脂质体介导的基因转染技术,以体外培养的肿瘤细胞系HeLa细胞和正常细胞系CV-1细胞作为受体细胞,进行转基因表达研究,发现cyclinG2高表达对体外培养细胞的增殖起明显抑制作用。应用p16INK4a、p21WAF1、p27KIP1三种周期蛋白依赖性激酶抑制因子的单克隆抗体对转基因的HeLa细胞进行免疫细胞化学研究,发现转染pIRES-G2的实验组细胞中,p21WAF1蛋白染色阳性细胞数明显多于转染空载体的对照组,平均光密度值高于对照组,两组间均有显著性差异(p<0.01),提示cyclinG2抑制细胞增殖作用可能是通过诱导p21WAF1的表达而实现。

G2/M期P53/CDK1通路对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨细胞周期G2/M期P53-P21WAF1-细胞周期依赖激酶1(cyclin dependent kinases 1,CDK1)通路与上皮性卵巢癌细胞增殖和凋亡的关系。方法分别将CDK1、p53基因特异性shRNA质粒及阴性对照质粒转染卵巢上皮性癌SK-OV-3、OVCAR-3细胞,MTT法、TUNEL法和FCM法分别检测细胞增殖、凋亡和细胞周期分布情况,Western blot法分别检测各组细胞中CDK1、磷酸化CDK1(Thr14/Tyr15)、P53、p-P53(ser15)、P21WAF1、Cyclin B1以及增殖和凋亡相关蛋白Ki-67、Survivin、Caspase3蛋白的表达。结果分别沉默CDK1、p53基因后,SK-OV-3和OVCAR-3细胞增殖受到抑制、凋亡增加、G2期细胞数目增加;Ki-67、Survivin蛋白表达减少,cleaved-Caspase3蛋白表达增加。此外,沉默p53基因可引起p-P53(ser15)和P21WAF1蛋白表达减少、p-CDK1(Thr14/Tyr15)蛋白表达升高。结论 G2/M检验点P53/CDK1信号通路可能参与卵巢癌上皮性细胞增殖和凋亡的调节。

CHK1-CDK1通路介导的G2/M检验点对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨检查点激酶1(CHK1)-细胞周期依赖激酶1(CDK1)信号通路异常与上皮性卵巢癌细胞增殖和凋亡的关系。方法:分别将CDK1、CHK1基因特异性shRNA质粒及阴性对照质粒转染卵巢上皮性癌SK-OV-3、OVCAR-3细胞,分别采用MTT法和流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡情况,分别采用RT-PCR和Western blot法检测各组细胞中CDK1和CHK1的表达情况,采用Western blot法检测各组细胞中p-CDK1、Cyclin B1、p-CHK1(ser345)、CDC25C、p-CDC25C以及增殖和凋亡相关蛋白PCNA、Ki-67、Caspase8、Cleaved-Caspase3的表达情况。结果:分别沉默CDK1、CHK1基因后,SK-OV-3和OVCAR-3细胞增殖受到抑制、凋亡率增加;PCNA、Ki-67蛋白表达减少,Caspase8、Cleaved-Caspase3蛋白表达增加(P<0.05)。此外,沉默CHK1基因可引起p-CHK1和p-CDC25C表达减少、p-CDK1蛋白表达升高(P<0.05)。结论:CHK1-CDK1信号通路介导的G2/M检验点参与调节卵巢癌细胞的增殖和凋亡。

高表达人cycli nG2基因的SGC-7901细胞克隆筛选和鉴定

应用脂质体基因转染技术建立稳定表达cyclin G2基因的胃癌克隆细胞,为深入研究cyclin G2在胃癌细胞周期调控的作用和机制提供理想的生物学模型。构建以新霉素基因作为筛选标志基因的包含人cyclin G2基因真核重组表达载体pIRES-G2,大量扩增纯化后经限制性内切酶BamH I/BstX I双酶切鉴定;利用阳离子脂质体介导的基因转染法将其和对照空载体pIRESneo转染人胃癌细胞SGC-7901,经G418选择性培养基筛选后有限稀释法连续克隆化,免疫细胞化学染色检测cyclin G2蛋白表达情况。酶切结果表明cyclin G2cDNA已成功插入pIRESneo的多克隆位点内;经G418筛选后在转染pIRES-G2和转染pIRESneo组均见多个细胞克隆出现,细胞化学染色证实pIRES-G2转染组cyclin G2蛋白的表达水平明显高于pIRESneo转染组;经过多次有限稀释获得稳定高表达cyclin G2的细胞克隆。应用脂质体转基因技术成功建立高表达cyclin G2基因的人胃癌细胞克隆。

绿色荧光蛋白-CCNG2表达载体的构建及鉴定

目的为进一步探讨细胞周期蛋白G2(CCNG2)基因功能奠定基础。方法以成人脑cDNA文库为模板,PCR扩增人CCNG2基因,In-Fusion技术定向克隆到pENTR1A中,酶切测序鉴定后重组到pcDNA6.2TM/EmG-FP-DEST Gateway载体,构建pcDNA6.2-EmGFP-G2。将鉴定正确的质粒瞬时转染人舌鳞癌细胞Tca-8113,24 h后观察,定量PCR检测CCNG2 mRNA表达。结果扩增得到1 032 bp的基因片段,经测序验证与GenBank中人CCNG2序列相符;pcDNA6.2-EmGFP-G2经酶切和测序鉴定无误。转染Tca-8113后,荧光信号除在胞质中表达外,在部分细胞的胞核DAPI染色弱信号区浓聚。转染该重组质粒后CCNG2 mRNA表达水平显著增高。结论成功构建了以绿色荧光蛋白作为报告基因的CCNG2表达载体,为进一步研究CCNG2基因功能奠定了基础。

周期蛋白G2在口腔鳞癌中的表达和意义

目的:探讨细胞周期蛋白G2(cyc lin G2)表达在口腔鳞癌发生和发展中的意义。方法:应用免疫组化S-P法检测39例口腔鳞癌组织和20例正常口腔黏膜组织中cyc lin G2的表达,通过显微图像分析系统分析其阳性率和平均积分光密度值的改变。结果:在正常口腔黏膜组织、高、中和低分化鳞癌组织中cyc lin G2的表达阳性率逐渐降低,分别为95%(19/20)、84.6%(11/13)、80%(12/15)和36.4%(4/11),差异显著(P<0.05);平均积分光密度值分别为1321.36±25.41、927.15±10.37、854.72±12.86和327.11±13.57,差异显著(P<0.05)。结论:cy-c lin G2在口腔鳞癌的发生、发展中起一定作用,是提示肿瘤恶性度的生物学指标之一。

细胞周期蛋白G2与肿瘤

细胞周期蛋白G2是一个崭新的细胞周期蛋白,它具有终止细胞周期和抑制细胞增殖的作用。在许多恶性肿瘤(如甲状腺乳头状癌和白血病)细胞中,其表达均发生显著下降,导致肿瘤细胞的去分化和无限制有丝分裂,为肿瘤的发生、发展提供了基础。低水平的细胞周期蛋白G2表达与肿瘤预后不良相关。研究和探索周期蛋白G2与肿瘤的关系,对进一步认识肿瘤的发生、发展有重要意义。

细胞周期素G1和G2在人食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的:探讨细胞周期素G1和G2(Cyclin G1,G2)在人类食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义。方法:收集2007年2月至2008年5月间蚌埠医学院第一附属医院病理科食管鳞状细胞癌存档蜡块60例,正常食管黏膜组织20例,所收集病例均有完整临床和病理资料。采用免疫组织化学Elivision染色方法检测上述组织中细胞周期素G1和G2的表达情况。结果:细胞周期素G1在食管鳞状细胞癌组织中表达的阳性率(61.7%)显著高于正常食管黏膜的阳性率25.0%(P<0.05),细胞周期素G2在食管鳞状细胞癌组织中表达阳性率(66.7%)显著低于正常食管黏膜的阳性率(90.0%)(P<0.05),两者的表达情况均与肿瘤组织的分化程度及有无淋巴结转移有相关性(P<0.05);食管鳞状细胞癌组织中细胞周期素G1和G2的表达呈显著负相关(P<0.05)。结论:随着食管鳞癌中Cyclin G1表达的增高,Cyclin G2的表达却下降,提示Cyclin G1和Cyclin G2相互之间存在负相调节作用,两者在食管鳞状细胞癌的发生、发展中具有重要作用。