大环糊精的酶法制备及应用研究进展

大环糊精(large ring cyclodextrin,LR-CD)是由9个至数百个吡喃葡萄糖单元组成的环状α-1,4-葡聚糖,主要通过环糊精葡萄糖基转移酶或4-α-糖基转移酶的环化作用使直链淀粉发生分子内转糖基作用得到。与常见α-、β-、γ-环糊精(cyclodextrin,CD)相比,LR-CD的空腔尺寸更大,表现出独有的结构和理化特性,这些性质使LR-CD在食品、医药、生物等领域展现出巨大的应用潜力。然而,LR-CD的制备成本高,产率较低,并且缺乏有效的分离纯化方法,因此目前还未实现工业化生产与应用。本文分别从优化底物、设计基于模板诱导的新反应路径、酶分子改造及产物的分离纯化等方面综述酶法制备LR-CD的研究近况与挑战,为LR-CD的工业化生产和应用提供参考。

棉花内生细菌YUPP-10及其分泌蛋白CGTase对棉花枯萎病的防治作用及机理

【目的】棉花枯萎病(Fusarium wilt)是棉花种植中较为严重的土传病害之一,主要采用化学方法进行防治,但对环境和人畜安全造成一定影响。生物防治因其专一性强、安全性高的特点,成为防治棉花枯萎病的重要途径。本研究旨在获得一株高效拮抗细菌,并明确其防治机理,为棉花枯萎病生物防治提供技术支持。【方法】前期获得一株能够破坏β-1,4糖苷键的棉花内生蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)YUPP-10,通过平板对峙培养、共培养法和悬滴法分别测试其对棉花枯萎病菌(尖镰孢,Fusarium oxysporum)菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响;利用YUPP-10菌液浸种处理,研究其对棉花生物量的影响;以尖镰孢菌土为基质种植棉花,生长1周后,用LB液体培养基培养的YUPP-10制成不同浓度(分别为1×10^(8)、1×10^(7)和1×10^(6) cfu/mL)的生防菌剂灌根处理棉苗,于温室中进行棉花枯萎病的防治效果研究;通过Fosmid文库筛选到了YUPP-10关键抑菌物质为环糊精糖基转移酶(CGTase,EC 2.4.1.19),研究其对尖镰孢菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响;利用拟南芥花序侵染法将其转化拟南芥,获得能够稳定表达CGTase的转基因株系,研究转基因拟南芥对枯萎病的抗性,以及在病原胁迫下部分防御基因的转录。【结果】YUPP-10菌株发酵液对尖镰孢菌丝生长、产孢和孢子萌发具有显著的抑制作用,随着发酵液浓度的升高,对尖镰孢产孢量和孢子萌发的抑制率越高,最高抑制率分别为98.41%和51.65%。低浓度的YUPP-10菌液能促进棉花种子发芽、出苗和地上部分的生长。YUPP-10发酵液灌根处理后,棉苗的病情指数和病株率显著降低,其中,1×10^(7) cfu/mL的YUPP-10发酵液对棉花枯萎病的防治效果最高,达到45.11%。YUPP-10菌株的关键抑菌物质CGTase能够水解羧甲基纤维素和葡甘聚糖,表明其具有破坏β-1,4糖苷键的能力,进而检测了其对尖镰孢的抑制效果,结果表明CGTase对尖镰孢的菌丝生长、产孢和孢子萌发具有显著的抑制作用,对产孢和孢子萌发的最高抑制率分别达到62.63%和30.83%。转CGTase的拟南芥提高了对枯萎病的抗性,过表达CGTase的拟南芥在病原胁迫下部分防御基因的转录水平升高。【结论】蜡状芽孢杆菌YUPP-10菌株能抑制尖镰孢的生长、促进棉花部分生物量指标的增长并控制枯萎病的危害,CGTase能够抑制尖镰孢的生长,转CGTase拟南芥对枯萎病的抗性增强。

离子束诱变产生的CGTase高产菌株发酵规律研究

对离子束诱变产生的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)高产菌株在10L全自动发酵罐中的发酵规律进行研究,结果表明:发酵过程中菌体生长和环糊精葡萄糖基转移酶的产生与发酵过程中pH和溶氧的变化直接相关;菌种传3代,发酵2 4h以内,产酶活力均在6 0 0 0IU

棕帘固定化环状芽孢杆菌ATCC21783制备CGTase

棕帘具有环境友好、耐腐蚀性强、可循环利用等特点,常用于水产养殖附苗。文中首次采用棕帘对细胞进行固定化,研究固定化过程中的接种量、固定化时间以及棕帘的投放数量对环糊精葡萄糖基转移酶的影响。结果发现,在50 mL培养基中,接种量为3%、固定化时间为1 d、棕帘(长2.5 cm,宽2 cm,高5 mm)的投放数量为2时,固定化细胞产酶量较高为5 519.05 U/mL。与现有报道的丝瓜瓤、丝瓜瓤-海藻酸钠、棕帘-海藻酸钠等固定化载体相比,棕帘具有成本低、操作简单、具有较好的操作稳定性等特点,在第7个循环中酶活性仍可达到第1个循环时的83.5%,有利于工业化推广应用。

一株产CGTase环糊精葡萄糖基转移酶的细菌改性甜菊苷的研究

本文对筛选的一株产CGTase环糊精葡萄糖基转移酶的细菌(Bacillus sp.CGT7)转化并改性甜菊苷进行了研究,探讨了影响酶活性和转化效果的因素.实验结果表明,在CGT7菌的培养过程中,碳源、氮源、温度和初始pH等因素对菌株产酶活性均有不同程度的影响,适宜的碳源为马铃薯淀粉,氮源为豆粕粉,培养温度为30℃,初始pH值为8.5.适宜条件下培养的CGT7菌的酶活性可达544 U/mL,以甜菊糖苷为底物、环糊精为糖基供体时,转糖苷产物Stv-Glu浓度为0.61 mg/mL.

超高压对α-CGTase产物专一性的影响

探讨了不同压力、不同温度对于α-CGTase产物专一性的影响,以及高压处理过后反应不同时间产物专一性的变化,确定了超高压作用于α-CGTase后环化反应产物专一性的变化规律。结果表明:在40℃,200 MPa下超高压不仅可显著提高α-CGTase产物专一性,同时保持较高酶活与产物得率。在40℃条件下,不同压力处理α-CGTase,随着压力升高,α-CGTase环化活力逐渐降低,反应产物专一性不断提高;在200 MPa下,不同温度处理α-CGTase,酶环化活力随温度升高而降低,产物专一性随温度升高先升高后降低;此外,高压处理α-CGTase后产物专一性随着反应时间的延长而降低。

环糊精的性能、生产及其在食品工业中的应用

本文介绍了环糊精的结构、性能、生产方法及其在食品工业中的应用等。

Bacillussp.HA-1产环糊精葡萄糖基转移酶发酵工艺研究

在10 L 发酵罐中,研究了环糊精葡萄糖基转移酶产生菌 Bacillus sp．HA-1的发酵规律,结果表明,在菌体对数增长期,发酵液溶氧处于较低状态,发酵液 pH 在对数增长前期持续下降,中期后回升,菌体产酶呈增长趋势；当菌体增长进入稳定期,发酵液溶氧迅速回升至初始状态,pH 也回升至起始值,菌体产酶接近峰值。根据发酵规律优化发酵工艺,通过有效增加菌体对数增长期发酵液溶氧,使菌株产酶到达高峰的时间缩短了 50%以上。应用该菌株在5 m^3生产罐中发酵,24 h 产酶水平达到6 800 IU/mL。

环糊精系列综述之一 环糊精葡萄糖基转移酶的筛选及其定向改造

环糊精因其特殊性质得到了食品、化妆品、医药等行业的青睐,全球消费量逐年稳步增加。环糊精的巨大需求也使其生产中所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶,EC 2.4.1.19)成为研究热点。目前,对该酶的研究多集中在作用机制、产物专一性机理等,鲜见从菌株筛选出发的系统性报道。因此,作者从野生CGT酶菌株的筛选出发,立足未来环糊精工业的商业诉求,综述了优质CGT酶获取的多种途径。同时结合国内外对CGT酶的大量研究工作以及我国的资源优势,对该领域未来的研究提出更高的期望。

嗜碱性芽孢杆菌N-227环状糊精葡基转移酶基因在枯草杆菌中的整合表达

大多数枯草杆菌载体在表达外源基因时会出现分离或结构不稳定,而将目的基因整合至染色体上的基因整合方法,近年来得到人们的普遍关注。通过构建一套整合载体,将β-环状糊精葡基转移酶基因随机整合至枯草杆菌1A289的染色体上,从表达氯霉素抗性及β-CGTase阳性株中选得菌株Bs2,其氯霉素抗性为5γ/ml,β-CGTase酶活为266u/ml。后又经多次整合及更高浓度氯霉素抗性的选择,获得一株Bs16-7-7菌株,在无选择压力下,表现出极为稳定的遗传表型,氯霉素抗性为125γ/ml,β-CGTase酶活达13000u/ml以上。

γ-环状糊精葡萄糖基转移酶产生菌32-3-10产酶条件及酶促反应条件的研究

筛选到一株芽胞杆菌 32 - 3- 10 ,它所产γ -环状糊精葡萄糖基转移酶可以淀粉为底物生成γ -环状糊精 ,对其产酶条件及酶促反应条件进行了研究。

β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株02-5-71的选育及发酵条件研究

应用氮离子注入对嗜碱芽孢杆菌进行诱变育种,获得了产生β-环糊精葡萄糖基转移酶是出发菌株2倍以上的高产菌株,酶活力可达6000U/mL以上.应用正交实验法筛选出最优发酵条件.

环糊精葡基转移酶对高血糖小鼠糖耐量和肝糖原影响的研究

通过对环糊精葡基转移酶在小白鼠糖尿病模型,以高(10 mg/kg)、中(1 mg/kg)、低(0.1 mg/kg)3个剂量腹腔注射的试验观察,探讨了环糊精葡基转移酶对小白鼠糖耐量和肝糖原的影响。结果显示:环糊精葡基转移酶可显著改善高血糖小鼠的糖耐量和增加高血糖小鼠的肝糖原含量,其作用效果与胰岛素效果相当。

响应面分析法优化β-环糊精的制备工艺

该文对β-环糊精制备工艺用响应面分析法优化进行了研究。结果表明,生产β-环糊精的最佳条件是选取木薯淀粉作为底物,不经过预处理,环状糊精葡萄糖基转移酶添加量是7U/g,环己烷的添加量0.5mL/g,体系CaCl2的浓度是50mmol/L,pH值8.25,温度63.72℃,反应时间9.04h,产率可达51.98%。优化后的生产工艺和传统工艺相比,反应时间缩短了5h,并且产率增高了1.13倍。

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75kDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km和Vmax值分别是50mg/ml和6.07mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+,Zn2+,Fe3+,Cu2+,Fe2+,Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为:酶量200μ/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。

环糊精葡萄糖基转移酶分离纯化及酶学性质研究

通过筛选和诱变获得一株高产环糊精葡萄糖基转移酶芽孢杆菌菌株,研究该菌所产环糊精葡萄糖基转移酶的分离纯化及酶学性质,结果显示:发酵液经离心处理后,采用硫酸铵溶液分步盐析、DEAE-cellulose 52离子交换层析、Sephadex G-200凝胶过滤层析方法得到电泳级环糊精葡萄糖基转移酶,SDS-PAGE电泳显示该酶分子量为33kD,纯化倍数为10,得率为14.4%。该酶反应的最适温度为50℃,在40～60℃基本稳定,最适pH值为8.0,在pH6.0～10.0范围内基本稳定。Fe2+、Cu2+、Mg2+对该酶活力有明显的抑制作用。

生淀粉生产环糊精的研究

介绍了以马铃薯生淀粉生产环糊精的方法。对生淀粉生产过程中的马铃薯、玉米、木薯生淀粉转化做了比较 ,并对反应条件对转化的影响做了研究。

甜菊糖的酶法改性

甜菊糖是一种天然的强力甜味剂 ,它的二种组分———甜菊苷和甜菊双糖C苷有苦味和不愉快的后味 ,会显著影响甜菊糖的味质。通过酶改性法在甜菊苷、甜菊双糖C苷中引入一些糖基 ,可以改善甜质。目前酶改性甜菊糖的方法主要有 :环糊精葡糖基转移酶法、β -呋喃果糖苷酶法、半乳糖苷酶法和微生物糖基化法。本论文对这几种酶改性方法作一详细介绍。

环糊精葡糖基转移酶的酶学性质及转化特性

目的:通过对一种强碱性环糊精葡糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性研究,探索改进和提高环糊精生产效率的工艺。方法:从一株碱性土壤来源的新型产环糊精葡糖基转移酶的嗜碱性芽孢杆菌,运用乙醇沉淀、DEAE-Sepharose和HiTrap-Q离子交换柱层析等蛋白质分离纯化技术对该酶进行了纯化,测定了其酶学性质,并对其转化特性进行了研究。结果:经过微生物发酵和三步纯化,获得表观电泳纯的酶蛋白,纯化倍数为51.4,收率约9.2%。该酶的最适反应温度为50℃。酶的最适作用pH约为10,并且在pH6～pH12条件下均较稳定。用5%可溶淀粉作底物进行转化,转化率约40%。在转化过程中加入沉淀剂环己烷,产物中β-CD的比例从84%提高到95%。结论:该酶是迄今报道过的适宜pH最高的环糊精葡糖基转移酶,专一性转化生产β-CD的能力优良,具有工业化应用的潜力。

应用02-5-71菌株葡萄糖基转移酶制备β-环糊精的研究

对环糊精葡萄糖基转移酶催化淀粉生成β 环糊精(β CD)的转化条件进行了研究.结果表明,转化最适pH为6.5～8.5;随底物浓度增加β CD生成量增多而转化率降低;酶用量在1000U.g-1淀粉较合适;5%甲苯及2%乙醇能显著提高β CD的转化率,以14%马铃薯淀粉为底物转化60h转化率较对照分别提高57.18%及28.36%;5%马铃薯淀粉加入10%乙醇转化24hr转化率可达57.97%.