指状青霉cyt b_5和cyt b_5r基因克隆及与cyp51A的共表达

为探究指状青霉细胞色素b5(Cyt b5)与细胞色素b5还原酶(Cyt b5r)在细胞色素P450 CYP51A电子传递方面的功用,研究了指状青霉CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达机制;并检测了其对于cyp51A基因表达水平的影响。通过转录组分析筛选并PCR克隆获得了cyt b5与cyt b5r基因,分别命名为HS-Pdcyt b5和HS-Pdcyt b5r。以多基因串联克隆载体p PICZαA为骨架构建了指状青霉共表达质粒ppbr A(p PIC-Pdcyp51A-cyt b5-cyt b5r);电转化法将重组质粒ppbr A导入毕赤酵母X-33中。q RT-PCR分析结果显示,CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达后,其基因表达水平升高54%-97%,并维持较长时间(48-72 h)。表明Cyt b5-Cyt b5r系统可将电子高效转移给CYP51A,从而增强cyp51A基因的转录表达。从指状青霉中克隆表达HS-Pd Cyt b5和HS-Pd Cyt b5r蛋白,并通过共表达的方式研究cyp51A基因的功能尚为首次报道。

烟曲霉cyp51A基因序列BLAST数据库的建立

目的构建我国烟曲霉cyp51A基因序列BLAST数据库。方法对本课题组收集的143株耐药与非耐药临床烟曲霉进行cyp51A基因测序,使用BLAST工具包汇总测序结果,构建本地数据库。结果此BLAST数据库包含143株耐药与非耐药烟曲霉cyp51A基因序列,以1株耐药与1株非耐药待测烟曲霉标本的cyp51A序列对此数据库进行检索和比对可以确定烟曲霉cyp51A基因型。结论本数据库有望用于cyp51A基因的检索与比对,鉴定烟曲霉cyp51A耐药基因型。

禾谷镰刀菌CYP51A基因对五种三唑类杀菌剂敏感性的影响

为进一步明确14α-脱甲基酶编码基因CYP51A在禾谷镰刀菌Fusarium graminearum对三唑类杀菌剂敏感性中的作用,利用Split-marker方法敲除禾谷镰刀菌CYP51A基因并获得敲除CYP51A基因的禾谷镰刀菌ΔFgCYP51A菌株,比较该菌株和野生型菌株PH-1对5种三唑类杀菌剂的敏感性变化。结果表明,ΔFgCYP51A菌株对丙环唑、戊唑醇、烯唑醇、三唑醇和三唑酮的EC_(50)分别为0.024、0.047、0.148、0.154和0.474 mg/L。ΔFgCYP51A菌株对戊唑醇、三唑醇、三唑酮和丙环唑的敏感性均显著增加,而对烯唑醇的敏感性无明显变化。表明FgCYP51A基因与禾谷镰刀菌对三唑类杀菌剂的敏感性有关。

临床烟曲霉菌株的生物特性及唑类耐药机制

目的 探究临床分离丝状真菌(命名AF70)的菌株生物学地位、生物学特性及其耐唑类药物的分子机制。方法 通过形态学和分子生物学技术明确AF70菌株的生物学地位。采用稀释点板法、甲基四氮盐(XTT)还原法、高效液相色谱法和大蜡螟幼虫存活试验探究AF70菌株的产孢能力、生物膜形成能力、麦角甾醇含量和毒力。通过微量液基稀释法和E-test法测定AF70菌株对三唑类,棘白菌素和两性霉素B的敏感性。Sanger测序法明确唑类药物靶基因cyp51A的突变类型,并通过Discovery Studio软件对CYP51A蛋白的三维结构进行分析。荧光定量PCR技术检测麦角甾醇合成和药物外排泵相关基因mRNA表达水平。结果 形态学和分子生物学鉴定AF70菌株为烟曲霉菌株。与标准菌株AF293相比,AF70菌株生物膜形成和产孢能力增加(P<0.05),但麦角甾醇含量差异无统计学意义(P>0.05)。药敏分析结果表明AF70菌株对伏立康唑和艾沙康唑耐药,对伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净敏感。AF70菌株的cyp51A基因突变类型为TR46/Y121F/T289A,并存在CYP51A蛋白的支链空间结构改变。同时,AF70菌株cyp51A和外排泵相关基因显著上调表达。结论 烟曲霉AF70菌株是由cyp51A基因突变、过表达以及外排泵基因过表达共同介导对VRC耐药。

临床分离的携带TR34/L98H型的耐唑类药物烟曲霉的耐药机制分析

目的对临床分离的耐唑类药物烟曲霉菌株进行耐药机制等相关研究。方法自1例侵袭性曲霉病(IA)患者的肺泡灌洗液(BALF)中分离得到1株烟曲霉,采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)M38-A2微量液基稀释法测定伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B和卡泊芬净对该菌株的最低抑菌浓度(MIC)/最低有效浓度(MEC),并对该菌株的唑类药物靶酶基因cyp51A进行克隆和序列测定分析,扩增并检测该菌株的9个微卫星标记位点,将其与国际上已经报告的具有相同耐药基因型的烟曲霉菌株进行非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类分析。结果伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B对该菌株的MIC分别为>16、2、0.5和2μg/m L,卡泊芬净对该菌株的MEC为0.25μg/m L。该菌株的cyp51A基因序列中存在启动子区-288^-322位间34 bp串联序列的插入,以及编码区T364A、T960A、T1554A的点突变,分别导致所编码蛋白98位、297位及495位氨基酸的置换(TR34/L98H/S297T/F495I)。微卫星分析显示,该菌株的微卫星分型与先前欧洲国家、亚洲其他国家分离的TR34/L98H/S297T/F495I型菌株不同。结论我们从1例IA患者BALF中分离到对唑类药物耐药的烟曲霉临床菌株,其耐药性是由cyp51A基因启动子区34 bp的串联序列插入结合基因编码区突变所致98位、297位及495位氨基酸置换(TR34/L98H/S297T/F495I)所介导,该菌株是中国所特有的、不同于国际上已描述的对唑类药物耐药的病原性烟曲霉。

白色念珠菌耐药株CYP51基因突变热点探讨

目的 探讨耐唑类药物白色念珠菌 CYP5 1基因突变发生热点。方法 从复发性外阴阴道念珠菌病( RVVC)患者分离出白色念珠菌 ,采用美国国家临床实验室标准化委员会 ( NCCL S)公布的酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案 ( M- 2 7方案 )进行体外药敏试验 ,分离出氟康唑 ( FL C)及伊曲康唑 ( ITC)的耐药株 ;根据 PCR- SSCP分析结果确定 CYP5 1突变热点是 136 4～ 1774 bp之间 ,随机选择 12株耐 FCZ( MIC≥ 6 4μg/ m l)及 ICZ ( MIC≥ 16μg/ m l)的白色念珠菌用 D1～ D2、E1～ E2 2对特异引物进行 PCR扩增 ,将其产物测序 ,并与 NCBI网站提供的白色念珠菌参考株进行比对、分析。结果 12株耐 FL C、ITC的白色念珠菌 ,扩增CYP5 1基因片段长度包括突变热点在内的 6 6 7对碱基 ,即从 110 8～ 1774 bp;在 12株菌当中 ,共发现 13个位点38个碱基突变 ,突变频率最高的位点是第 15 87位中腺嘌呤 ( A )被鸟嘌呤 ( G)取代 ;37个碱基突变没有引起氨基酸的改变 ,为无意义突变 ,只有 16 0 9位的鸟嘌呤 ( G)被腺嘌呤 ( A)所取代 ,导致第 4 88位的缬氨酸被异亮氨酸取代 ( V4 88I)。结论 CYP5 1基因突变是白色念珠菌对唑类抗真菌药物耐药机制之一 ;CYP5 1基因突变热点在136 4～ 1774 bp之间 ,但 92 .3%的碱基突变?

玉米黑粉菌cyp51基因结构分析与克隆表达

通过生物信息学手段分析cyp51基因结构,并根据GenBank登记的玉米黑粉菌cyp51 DNA序列,设计cyp51引物和两对分别截短不同跨膜区的突变体引物,构建了多种重组表达质粒及突变体重组表达质粒。选用不同宿主菌包括Escherichia coli BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)诱导表达并优化条件。SDS-PAGE分析结果表明:只有突变体pET32--35能够在E.coli BL21(DE3)中高效表达(30oC,0.5 mmol/L IPTG诱导)。通过与戊唑醇等4种商品化杀菌剂农药和14种XF系列农药先导化合物的紫外结合光谱分析表明:重组蛋白具有生物学活性。其中一种XF系列化合物的结合常数接近商品化杀菌剂,有可能开发为新的杀菌剂,为设计开发新型高效抗真菌新药提供了理论依据。

甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)的研究进展

甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)是分布最广的细胞色素P450家族成员,是生物甾醇合成过程中的关键酶。故CYP51不仅是细胞色素P450蛋白结构、功能、结构与功能关系等研究的模板,而且是重要的降胆固醇药物、抗真菌药物和除草剂作用靶标,具有重要的经济价值。以下就CYP51家族的序列特征、功能(生理功能和生化特征)、结构、结构与功能的关系、CYP51活性的抑制等方面的研究进展进行了综述。并对CYP51抑制剂的研究局限方面进行了讨论,探讨了CYP51抑制剂设计开发的相关问题。

虾夷马粪海胆CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析

采用RT-PCR、PCR-SSCP等分子生物学技术和关联分析等方法对虾夷马粪海胆Strongylocentrotusintermedius CYP51基因的cDNA序列进行了克隆和单核苷酸多态性分析。结果表明:虾夷马粪海胆的CYP51基因包括一个1 491 bp的开放阅读框,编码496个氨基酸;其开放阅读框的第161个核苷酸处存在1个单核苷酸多态性,即核苷酸发生了A→G突变。关联分析结果表明,该单核苷酸多态性与虾夷马粪海胆的体质量、性腺质量之间存在显著相关性(P<0.05)。本研究中首次克隆了虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列并进行了SNPs分析,研究结果可为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考。

唑类耐药白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶基因的研究

目的探讨白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)基因突变与对唑类抗真菌药物耐药的关系,从分子水平了解其耐药机制。方法纸片扩散法和NCCL公布的M-27方案测定耐药株对氟康唑和伊曲康唑的MIC;设计引物,PCR扩增唑类耐药白色念珠菌的CYP51基因;扩增产物测序并与Genbank序列相比较分析。结果扩增产物测序分析表明,成功扩增到白色念珠菌CYP51基因。与X13296株序列相比较,两个耐药株都存在有意义突变和无意义突变。两株菌共有22个碱基突变。与以往报道的相同,突变发生氨基酸替换的有F105L、K128T、Y133H、T199I、R267H、G464S和G467K。其中,两株菌都有Y132H和G467K突变。F71L、W244R、T311N和T352I为新发现的突变,未见报道。同时,也发现了9个未发生氨基酸替换的突变。结论白色念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药与CYP51基因突变有关,且为多位点突变。

禾谷镰刀菌致病性蛋白CYP51C cDNA克隆及生物信息学分析

本研究采用RT-PCR技术,克隆获得禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)致病性CYP51C蛋白基因c DNA序列,并对蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析,明确其序列典型特征。结果表明:其c DNA序列全长为1 554 bp,编码517个氨基酸;该蛋白分子量为58.6 k D,等电点为6.36;含有细胞色素P450家族成员典型的保守结构域;不具有信号肽,属于非分泌性蛋白;具有跨膜结构域,是亲水性蛋白;蛋白质二级结构最主要的结构元件是α螺旋和无规则卷曲;亚细胞定位预测显示CYP51C蛋白主要位于细胞质中。这些研究结果为蛋白纯化及其蛋白结构生物学研究提供参考,进而可为病原真菌药物靶标设计奠定基础。

氮唑类抗真菌药物靶酶CYP51的研究进展

氮唑类药物是临床上应用最广、种类最多的广谱高效抗真菌药物,其作用靶点为真菌甾醇合成过程中的一个关键酶——羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)。CYP51由CYP51基因(同名ERG11)表达。一方面,真菌CYP51是跨膜蛋白,难以纯化获得其准确的结构信息,成为药物研发的瓶颈之一;另一方面,CYP51变异是公认的真菌耐药的主要原因之一,研究其结构变化对于抗真菌耐药具有重要意义。因此,笔者对近年来CYP51的研究进展进行综述。

2,3-二芳基-1,3-苯并噁嗪的合成及对利什曼原虫CYP51活性的初步研究

首次对2-(2-硝基苯基)-3-(4-甲基苯基)-1,3-苯并噁嗪(1)与利什曼原虫CYP51的相互作用进行了初步研究,发现化合物1对利什曼原虫CYP51表现出较强的抑制活性,且作用方式类似于底物与利什曼原虫CYP51的I型结合方式.该研究不仅发现了一种新型非唑类针对利什曼原虫CYP51的抑制剂:1,3-苯并噁嗪,而且也为创制新型作用方式的CYP51抑制剂研究提供了依据.

小立碗藓细胞色素P450基因PpCYP51G1的分离及转化载体构建

从小立碗藓(Physcomitrella patens)中克隆了细胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1的全长编码序列,编码区长1 509 bp,预测编码488个氨基酸,蛋白二级结构含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋,N端含有一个跨膜区域。构建了PpCYP51G1的功能缺失载体,并利用PEG介导的原生质体转化技术获得该基因的功能缺失转化体;同时,构建了PpCYP51G1-GFP融合蛋白载体,亚细胞定位结果表明,PpCYP51G1定位在内质网中。

小麦赤霉病菌对叶菌唑的抗性风险分析

采用菌丝生长速率法,测定了2012‒2014年采自我国江苏、安徽、山东和河南4个省份的100株小麦赤霉病菌对叶菌唑的敏感性,并通过室内药剂驯化获得叶菌唑抗性突变体,研究了抗性突变体的适合度及CYP51基因序列和表达量。结果表明:叶菌唑对供试菌株的EC50值范围为0.04~0.51μg/mL,平均EC50值为(0.18±0.09)μg/mL,供试菌株对叶菌唑的敏感性频率分布呈近似正态的连续性单峰曲线,尚未出现抗药性亚群体,可将该平均EC50值作为敏感性基线的参考值,用于监测田间抗药性的演化。通过室内药剂驯化共获得12株抗性突变体,其中2株表现为中等水平抗性,抗性倍数(RI)分别为14.2和15.8,10株表现为低水平抗性,RI值为3.25~9.05。与亲本菌株相比,部分抗性突变体的菌丝生长速率及分生孢子产生能力均显著降低,所有抗性突变体对小麦的致病力均显著降低。交互抗性研究表明,部分抗性突变体对戊唑醇、丙环唑及咪鲜胺表现为抗性,对丙硫菌唑和三唑酮未表现出抗性;部分抗性突变体仅对戊唑醇表现为抗性,对丙环唑、咪鲜胺、丙硫菌唑和三唑酮均未表现出抗性;所有抗性突变体对氰烯菌酯均表现为敏感。研究表明,小麦赤霉病菌对叶菌唑存在低等抗性风险。与亲本菌株相比,2株中等水平和2株低水平抗性突变体的CYP51基因及启动子序列均未发生突变;4株抗性突变体的CYP51A基因表达量均上调,上调倍数范围为1.33~10.28,推测CYP51A基因表达量上调可能与小麦赤霉病菌对叶菌唑抗性的产生相关。

甘蔗梢腐病菌Fusarium sacchari CYP51基因克隆及遗传转化

甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)是生物细胞膜合成所需的一个非常重要的酶,在病原菌的耐药性、致病性和生长繁殖等方面发挥着非常重要的作用。研究表明干扰真菌的CYP51基因表达导致其无法正常生长,显著降低其致病性。本研究以甘蔗梢腐病菌甘蔗镰刀菌(Fusarium sacchari)为试验材料,根据基因组测序数据设计特异性引物克隆得到了FsCYP51基因全长和CDS全长。生物信息学分析表明,该基因序列全长1947 bp,编码区由2个内含子和3个外显子组成,CDS全长1554 bp,编码517个氨基酸,编码蛋白理论相对分子量为58.61 kDa。其编码蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成,具有典型的CYP51保守结构域。预测其亚细胞定位于细胞膜,且存在2个跨膜区域。系统进化分析表明,FsCYP51基因属于CYP51C这一类,与串珠镰刀菌(F.verticillioides)的CYP51C基因亲缘关系最近。同时,根据克隆到的基因全长和CDS全长构建了多价HIGS植物表达载体,并利用基因枪介导的遗传转化方法将干扰片段成功转化至甘蔗受体材料,为研究FsCYP51基因功能和创制抗梢腐病甘蔗种质奠定基础。

曲霉菌对唑类抗真菌药物的耐药机制研究进展

侵袭性曲霉病是由致病曲霉菌引起的危及生命的真菌感染,主要致病菌为烟曲霉,而唑类抗真菌药物是临床治疗的首选。目前已上市的唑类抗真菌药物包括伊曲康唑,伏立康唑,泊沙康唑和伊沙康唑。然而,流行病学研究发现曲霉菌对唑类抗真菌药物的耐药率呈逐年上升趋势,给临床治疗造成了威胁。其中,Cyp51A蛋白突变、外排系统高表达以及环境耐药机制等多种因素都参与唑类抗真菌药物的耐药。因此,本文综述近年来有关曲霉菌对唑类抗真菌药物的耐药机制,以期为耐药监测、耐药菌控制和新药研发提供理论依据。

同位素掺入法测定耐药白念珠菌CYP51酶活性

目的 通过同位素掺入法测定耐药白念珠菌CYP51酶活性。方法 分别用[1-^14C]乙酸整体细胞掺入实验和离细胞酶的[2-^14C]甲羟戊酸掺入实验，再经薄层色谱和液体闪烁计数，计算氟康唑对真菌细胞膜麦角甾醇生物合成的半数抑制浓度IC50。结果 耐药菌的IC50值有不同程度的提高，与敏感株相比提高显著。但不同菌株结果有差异。结论 用同位素掺入法测定耐药白念珠菌CYP51酶活性，发现CYP51酶对氟康唑的敏感性有显著性差异。为真菌耐药性的研究和抗真菌药物的临床应用提供了一定的参考。