RyhB-cysE基因对禽致病性大肠杆菌生物表型的影响

在禽致病性大肠杆菌(APEC)AE17及AE17△RyhB的基础上利用Red同源重组技术构建基因缺失株AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE,对野生株和基因缺失株的生长、生物被膜形成和运动特性进行分析,并采用qRT-PCR技术比较野生株和缺失株中与运动性、生物被膜形成相关基因的转录水平。结果显示,各菌株生长曲线无显著差异;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力较AE17显著下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE运动能力与AE17相比下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比flhB、flgD、fliF和cheY转录水平均降低,而AE17△RyhB△cysE与AE17△cysE相比基因转录水平均有所增强;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比,flhD、flgC、sidA转录水平均显著降低。表明cysE基因缺失降低了APEC生物被膜形成能力及运动能力,且RyhB基因缺失对cysE基因的运动能力调控作用有代偿作用,RyhB、cysE基因均通过调节与生物被膜形成相关的基因(flhD、flgC、sidA)转录水平调控APEC生物被膜形成能力,本研究结果为研究RyhB-cysE基因对APEC的调控作用奠定了基础。

大肠杆菌cysE和cysM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】克隆大肠杆菌半胱氨酸合成酶(包括丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysM))的基因,对其进行原核表达,并制备相应蛋白的抗体。【方法】用PCR方法从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增cysE和cysM基因,构建其原核表达载体pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM,对其进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot(以His抗体作为一抗)检测。用纯化的cysE和cysM蛋白作为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价。【结果】PCR获得了822bp的cysE基因和912bp的cysM基因。原核表达质粒pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM构建成功,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的cysE和cysM重组蛋白分子质量分别为56和58ku。制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度均达到1∶102 400。【结论】成功克隆了大肠杆菌cysE和cysM基因,并实现了原核表达,同时制备出了相应的多克隆抗体。