芪地糖肾方调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导高糖刺激肾小球内皮细胞焦亡的研究

目的 探究芪地糖肾方通过NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1/消皮素D蛋白(NLRP3/Caspase-1/GSDMD)通路介导高糖刺激的肾小球内皮细胞焦亡的作用。方法 将肾小球内皮细胞分为正常组、高糖组、芪地糖肾方组,分别予完全培养基、30 mmol/L高糖培养基、30 mmol/L高糖培养基+芪地糖肾方100μg/mL培养48 h,采用细胞免疫荧光染色法观察细胞中NLRP3表达情况及细胞骨架情况,采用Western blot法检测细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、消皮素D蛋白(GSDMD)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)表达情况。结果 与正常组比较,高糖组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),NLRP3荧光表达信号增强,细胞骨架损伤明显;与高糖组比较,芪地糖肾方组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),NLRP3荧光表达信号减弱,细胞骨架损伤状态改善。结论 芪地糖肾方可通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡相关通路激活改善高糖诱导的肾小球内皮细胞损伤。

癫癎模型大鼠海马神经元凋亡细胞中caspase3新底物的寻找

目的:在癫癎模型大鼠海马神经元凋亡细胞中寻找caspase 3新底物。方法:建立癫癎模型大鼠海马组织cDNA文库,构建含caspase 3的P12和P17两亚基的三杂交诱饵载体,检测其效果,并进行酵母三杂交筛库。结果:成功建立了癫癎模型大鼠海马组织cDNA文库,构建了大鼠caspase 3基因的酵母三杂交诱饵载体,并通过caspase 3与eIF2α之间的相互作用验证;以此三杂交诱饵载体筛库获得caspase 3的新底物PIAS1及MIZ1。结论:从癫癎模型大鼠海马的cDNA文库中筛库获得caspase 3的新底物,为进一步研究caspase 3在癫癎发作引起海马神经损伤中的作用创造了条件。

脊髓损伤大鼠脊髓及泌尿生殖道caspase-3和nNOS表达的改变

目的:观察SD大鼠脊髓损伤后脊髓及泌尿生殖道凋亡促进因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和一氧化氮合成酶(nNOS)表达的改变。方法:成年雄性SD大鼠16只,随机分为对照组(n=8)和脊髓损伤组(n=8);脊髓损伤组采用改良的重物坠落法(Allen法)制作大鼠T9-T10脊髓节段不完全损伤模型。分别行caspase-3免疫组化及nNOS免疫组化染色,用半定量方法评价正常及脊髓损伤大鼠脊髓、膀胱壁及阴茎组织表达caspase-3和nNOS的改变情况。结果:脊髓损伤后大鼠脊髓内nNOS和caspase-3均表达增强(P<0.001),而膀胱壁及阴茎组织内caspase-3表达增强(P<0.001),nNOS表达减弱(P<0.001)。结论:脊髓损伤大鼠脊髓及泌尿生殖道表达caspase-3和nNOS发生了改变,但并非同步,机制各有不同。

海人藻酸致痫大鼠海马神经元凋亡中caspase-3作用的实验研究

目的阐明癫痫模型大鼠海马神经元凋亡中caspase-3的作用机制。方法以TUNEL法检测KA致痫大鼠海马神经元凋亡情况,以WesternBlot方法检测其海马神经元中eIF2α的表达变化。取模型鼠海马组织制备cDNA文库,以caspase-3的大小亚单位构建酵母三杂交诱饵载体,并进行酵母三杂交筛库实验。结果在癫痫发作后12h海马出现凋亡神经元,72h达高峰;发作后24h海马神经元出现eIF2α被caspase-3酶切的片段,逐渐增加至72h。成功制备癫痫模型大鼠海马组织cDNA文库,构建了caspase3酵母三杂交诱饵载体,验证了caspase3与eIF2α之间的相互作用,并经筛库获得caspase3的新底物PIAS1。结论在癫痫模型大鼠海马凋亡神经元中eIF2α被caspase3酶切。酵母三杂交技术可用于筛库寻找caspase3下游底物,从癫痫大鼠海马中获得caspase3的新底物PIAS1,为进一步研究在癫痫发作致神经元损伤中caspase3的作用建立了基础。

运动训练对脑出血大鼠脑组织中IL-10和caspase-3表达的影响

目的:研究运动训练与脑出血大鼠脑组织中白细胞介素-10(IL-10)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的相互关系,探讨运动训练促进脑出血(ICH)后神经功能恢复的机制。方法:采用自体血注入法将80只SD大鼠制作成右侧纹状体脑出血模型,造模成功后按照随机化的原则将其分为对照组和运动训练组(运动组),每组又分为第1、3、7、14、21天5个时间点。运动组行网屏训练、平衡木训练、滚笼训练,对照组不作任何干预。分别于不同时间点对大鼠进行神经功能评分。然后将其处死,取右侧脑组织用免疫组化和原位杂交的方法检测IL-10和caspase3的蛋白及mRNA表达。结果:在脑出血后第14天和第21天运动组大鼠的神经功能评分优于对照组,运动组大鼠的IL-10表达高于对照组;在脑出血后第7天运动组大鼠的caspase3表达低于对照组。结论:运动训练可使脑出血大鼠脑组织内IL-10含量增高,而使caspase-3的含量降低,这可能是运动训练促进神经功能的恢复机制之一。

caspase-3在颞叶癫痫大鼠海马神经凋亡中作用的实验研究

目的构建癫痫模型大鼠海马凋亡神经元的cDNA文库,采用酵母三杂交技术从中寻找caspase-3潜在的酶切底物。方法制作海人藻酸大鼠癫痫模型,取其海马组织制作酵母三杂交cDNA文库,克隆获得caspase-3的P12、P17两亚基,然后分别定向插入同一pBridge质粒,构建caspase-3的酵母三杂交诱饵载体并进行验证,然后对所构建文库进行筛库。结果成功构建癫痫模型大鼠海马组织cDNA文库,构建了caspase-3酵母三杂交诱饵载体,并通过caspase-3与eIF2α之间的相互作用验证,经筛库获得caspase-3的底物MIZ1。结论酵母三杂交技术可用于寻找caspase-3下游底物,从癫痫模型大鼠海马的cDNA文库中筛库获得caspase-3的底物MIZ1,为进一步研究caspase-3在癫痫发作引起的海马神经元损伤中的作用奠定了基础。

Caspase3基因克隆及在癫痫样放电海马神经元中的表达

目的 探讨海马神经元癫痫样放电引起神经元丢失的机制。方法 采用RT PCR法克隆大鼠全长Caspase3cDNA ,然后采用原位杂交和流式细胞技术检测了海马神经元癫痫模型中Caspase3基因表达和神经元凋亡情况。结果 获得了大鼠的全长Caspase3cDNA ,发现海马神经元癫痫样放电后出现Caspase3基因表达和神经元凋亡的现象。结论 癫痫样放电启动Caspase3表达 ,继而介导神经元凋亡。

不同压力高压氧预处理与大鼠脑缺血灌注损伤缺血半暗带神经元细胞凋亡

目的:观察不同压力高压氧预处理(HBO-PC)对大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带神经细胞凋亡的影响。方法:将48只Wistar大鼠随机分为3组:假手术组(n=8);对照组:大脑中动脉闭塞(MCAO)模型组(n=8);实验组:HBO-PC+MCAO组(n=32)。实验组再按不同的HBO-PC压力分为1.5ATA(0.15MPa)、2.0ATA(0.20MPa)、2.5ATA(0.25MPa)和3.0ATA(0.30MPa)4个亚组,每组8只。按不同治疗压力,每次吸氧1h、隔天1次、共5次,10d完成。最后一次HBO-PC24h后,根据Zea-Longa线栓法制作MCAO再灌注损伤模型,缺血2h再灌注24h后用免疫组织化学法和原位末端脱氧核糖转移酶标记(TUNEL)法检测脑缺血半暗带神经细胞凋亡情况。假手术组和对照组不进行HBO或常压氧治疗,10d后处理同实验组。结果:实验组动物行为改善,脑梗死灶缩小,脑缺血半暗带凋亡细胞数和半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)阳性细胞数不同程度降低,B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)表达不同水平增高,与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05);而2.0ATA和2.5ATA压力条件相比较1.5ATA和3.0ATA上述凋亡指标差异亦有显著性(P<0.05);但2.0ATA和2.5ATA间,1.5ATA和3.0ATA间差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:通过下调缺血半暗带神经元线粒体途径的凋亡水平,HBO-PC可以减轻大鼠脑缺血再灌注损伤,组内比较2.0ATA和2.5ATA下HBO-PC优于1.5ATA和3.0ATA。

丹参7种水溶性有效成分配伍对脑缺血再灌注所致记忆损伤模型小鼠的影响

目的:探讨前期研究筛选出的丹参七种水溶性有效成分最优配伍组合样品A2、B4、C11对脑缺血再灌注(ischemia reperfusion)小鼠学习记忆的保护作用。方法:采用改进的Himori法暂时性阻断两侧颈总动脉制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用水迷宫实验,观察配伍组合样品对脑缺血再灌注小鼠记忆功能的保护作用,检测小鼠断头耐缺氧存活时间,脑组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase,ACh E)活力及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。免疫组织化学方法检测小鼠海马神经元凋亡相关天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-asparate protease-3,caspase-3)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的表达。结果:丹参7种水溶性有效成分配伍组合样品B4、C11可明显改善小鼠脑缺血再灌注所致的记忆障碍,增强耐缺氧能力,提高脑内SOD,CAT活性,降低ACh E活性和MDA含量;抑制凋亡蛋白caspase-3表达,上调NGF表达。其中以B4(2.8μmol·L-1)、C11(30.0μmol·L-1)组作用最为明显(P<0.01),A2各个剂量组效果不显著(P>0.05)。结论:丹参7种水溶性有效成分配伍组合样品B4、C11对脑缺血再灌注损伤小鼠记忆功能有保护作用,其机制可能通过提高清除脑内自由基能力,抑制小鼠神经细胞凋亡,促进神经再生,来减轻脑缺血再灌注引起的脑组织损伤。

牛磺酸对大鼠肢体缺血-再灌注后肝脏TNF-α、Caspase-3表达及细胞凋亡的影响

目的观察肢体缺血-再灌注(LI-R)后大鼠肝脏损伤中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3表达及细胞凋亡的发生和牛磺酸预处理后对其的影响。方法Wistar大鼠建立LI-R损伤模型后,随机分为对照组、LI-R组和牛磺酸+LI-R(TR)组。测定各组动物肝组织丙二醛(MDA)、髓过氧物酶(MPO)、肝组织钙含量、TNF-α水平;免疫组化法观察Caspase-3蛋白表达;利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯状条带;TUNEL法检测各组肝脏细胞的凋亡情况。结果与对照组比较,LI-R组和TR组大鼠肝脏各损伤性指标、TNF-α水平及Caspase-3蛋白表达增高,肝脏细胞DNA琼脂糖凝胶电泳可见梯状条带,TUNEL染色结果显示凋亡百分率明显升高(P<0.05)。TR组上述各项指标较LI-R组显著降低(P<0.05),肝脏细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带不明显。结论细胞凋亡参与了LI-R肝损伤的发生;牛磺酸预处理可降低TNF-α、Caspase-3表达,从而减少大鼠LI-R后肝脏细胞凋亡的发生。

慢性高原病患者骨髓有核红细胞凋亡及Caspase-3的表达

目的探讨慢性高原病患者骨髓有核红细胞凋亡情况和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达水平。方法选择2016年1月至2018年3月在青海省人民医院治疗的慢性高原病20例男性患者作为观察组,选择同期同海拔地区的20例健康男性作为对照组。分离并培养骨髓单个核细胞并培养3 d,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定(TUNEL)法检测有核红细胞的凋亡指数,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Caspase-3 mRNA的相对表达量。结果培养基内细胞生长良好,圆形透亮。瑞士染色后光镜下进行观察,有核红细胞占(90. 1±4. 0)%。观察组凋亡指数为(7. 4±2. 4)%,低于对照组的(17. 5±5. 7)%,差异有统计学意义(P <0. 05)。观察组Caspase-3 mRNA的相对表达量为(0. 7±0. 3),高于对照组的(0. 5±0. 2),差异有统计学意义(P <0. 05)。观察组Caspase-3 mRNA的相对表达量与凋亡指数呈负相关(r=-0. 684,P <0. 05),凋亡指数与血红蛋白浓度呈负相关(r=-0. 534,P <0. 05),而Caspase-3 mRNA的相对表达量与血红蛋白浓度未见明显相关性(P> 0. 05)。结论慢性高原病患者骨髓有核红细胞凋亡指数降低,Caspase-3 mRNA表达水平增高,提示Caspase-3可能参与了慢性高原病骨髓造血细胞凋亡的异常机制。

HAX-1和Caspase-3在皮肤鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的研究造血细胞特异蛋白1相关蛋白X1(HAX-1)和Caspase-3在皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中的表达及临床意义。方法采用免疫组化法检测72例cSCC组织和38例正常皮肤组织中HAX-1和Caspase-3的表达,分析其与临床病理特征的关系。结果与正常皮肤组织相比,HAX-1在cSCC组织中表达增加,而Caspase-3表达降低(P<0.01)。HAX-1表达与肿瘤厚度、TNM分期和分化程度密切相关(P<0.05);Caspase-3表达与TNM分期和分化程度具有相关性(P<0.05)。cSCC组织中HAX-1与Caspase-3表达呈负相关(r=-0.875,P<0.05)。结论 HAX-1在cSCC组织中高表达,而Caspase-3低表达。HAX-1和Caspase-3可能与cSCC发生、发展密切相关,有望成为其预后判断和治疗的新靶点。

桔梗皂苷D对结直肠癌HT-29细胞增殖、凋亡、迁移和糖酵解的影响

目的探讨桔梗皂苷D对结直肠癌HT-29细胞增殖、凋亡、迁移和糖酵解的影响。方法选取人类HT-29细胞,随机分为对照组及桔梗皂苷D 25、50、100μmol/L组,桔梗皂苷D 25、50、100μmol/L组分别用25、50、100μmol/L桔梗皂苷D处理48 h,通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和集落形成实验考察细胞增殖情况,采用流式细胞仪和免疫印迹实验考察细胞凋亡和凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)的表达,通过Transwell和免疫印迹实验考察细胞迁移情况,并检测葡萄糖消耗、乳酸产生以及HT-29细胞中丙酮酸激酶M2型(PKM2)和磷酸化PKM2(p-PKM2)表达水平。结果随着处理时间的递增,对照组和桔梗皂苷D 25、50、100μmol/L组HT-29细胞存活率逐渐降低;与对照组比较,桔梗皂苷D 25、50、100μmol/L组HT-29细胞存活率均降低(均P<0.001)。与对照组比较,桔梗皂苷D 25、50、100μmol/L组HT-29细胞的集落数由50分别降为36、34、16(均P<0.001)。与对照组相比,桔梗皂苷D 100μmol/L组HT-29细胞的凋亡率由39%提高至62%,Bax相对表达由0.1提高至0.9,cleaved Caspase-3由0.15提高至1.25(均P<0.001),Bcl-2由0.75降低至0.12(P<0.001)。与对照组相比,桔梗皂苷D 100μmol/L组HT-29细胞单位视野数量由48个降低为16个,蜗牛同源转录因子(Snail)相对表达由1.3降低至0.5,上皮钙黏蛋白(E-cadherin)相对表达由0.1提高至1.2,葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的相对表达由1.1降低为0.2,乳酸脱氢酶A(LDHA)的相对表达由1.2降低为0.2,己糖激酶2(HK2)的相对表达由1.00降低为0.15(均P<0.001)。与对照组相比,桔梗皂苷D 100μmol/L组HT-29细胞葡萄糖消耗量由对照组的4.8 mmol/L降低为1.9 mmol/L,乳酸产生量由9.2 mmol/L降低为3.8 mmol/L(均P<0.001)。与对照组相比,桔梗皂苷D 100μmol/L组PKM2的相对表达由1.0降低为0.1,p-PKM2相对水平由0.75降低为0.08(均P<0.001)。结论桔梗皂苷D可以抑制HT-29细胞增殖,促进细胞凋亡,并抑制HT-29细胞迁移和糖酵解。

雷公藤甲素诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡

目的探讨雷公藤甲素对人胰腺癌PANC-1细胞增殖和凋亡的影响。方法应用不同浓度雷公藤甲素(10、20、40、80、160ng/ml)作用于体外培养的人胰腺癌PANC-1细胞。MTT方法观察药物对细胞生长抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-PCR法和Western blot法分别检测热休克蛋白70(HSP70)mRNA和蛋白表达;半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性检测分析其凋亡机制。结果雷公藤甲素明显呈剂量依赖性抑制人胰腺癌PANC-1细胞的增殖,诱导细胞凋亡(P<0.05)。应用雷公藤甲素后,PANC-1细胞内HSP70mRNA和蛋白表达明显呈浓度依赖性降低,同时细胞质内Caspase-3活性随剂量增加而增加(P<0.05)。结论雷公藤甲素体外能够抑制人胰腺癌PANC-1细胞生长,诱导细胞凋亡发生。其机制可能与抑制细胞HSP70表达和增加Caspase-3活性有关。

基于网络药理学和分子对接探讨鸦胆子治疗结直肠癌的作用机制

目的采用网络药理学结合分子对接及体内验证,探究鸦胆子Brucea javanica治疗结直肠癌的活性成分、关键作用靶点及潜在的分子机制。方法从公共数据库中检索并收集鸦胆子的活性成分和对应的靶点以及结直肠癌相关的靶点,通过网络药理学分析出鸦胆子治疗结直肠癌的活性成分、成分-疾病的交集靶点以及可能的信号通路。通过分子对接预测活性成分与靶点蛋白的结合能力。通过体内实验进一步验证鸦胆子活性成分治疗结直肠癌的作用和作用机制。结果在满足筛选条件的15个成分中共筛出鸦胆子苦醇、木犀草素、鸦胆子苷B、β-谷甾醇4个鸦胆子生物活性成分及32个鸦胆子治疗结直肠癌的作用靶点,表皮因子生长受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinasparate protease-3,Caspase-3)及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)是鸦胆子治疗结直肠癌的关键靶点,EGFR/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路可能在鸦胆子治疗结直肠癌中发挥重要作用。分子对接结果表示4个生物活性成分均可较好结合,其中鸦胆子苦醇与3个关键靶点的平均结合能负值最大,结合最稳定,可能是鸦胆子抗结直肠癌最有效的活性成分。动物实验结果表明,与对照组比较,鸦胆子苦醇明显抑制裸鼠体内移植瘤的体积和质量(P<0.01),下调肿瘤组织中EGFR、PI3K和Akt的蛋白表达水平(P<0.01),下调与G1/G0期细胞阻滞相关的cyclin D1和细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)的表达(P<0.01),上调与肿瘤细胞凋亡相关的cleaved Caspase-3表达及B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein,Bax)/B淋巴细胞瘤-2(Bcell lymphoma-2,Bcl-2)值(P<0.01),下调与迁移和侵袭相关的蛋白基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、MMP7表达(P<0.01);鸦胆子苦醇组裸鼠肝功能、肾功能及血液指标均未见显著性差异。结论鸦胆子能够通过多靶点、多通路治疗结直肠癌,其主要活性成分为鸦胆子苦醇,其机制可能与抑制EGFR/PI3K/Akt信号通路从而引起G1/G0期阻滞,抑制增殖、侵袭和迁移,促进细胞凋亡有关。

奥曲肽对人肝癌细胞Huh-7增殖、细胞周期和凋亡的影响

目的探讨奥曲肽对人肝癌细胞Huh-7增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法 Huh-7细胞用不同浓度奥曲肽(0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L,分别为A、B、C、D、E、F组)处理,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达。结果与A组相比,其余各组Huh-7细胞的生长抑制率、G1期细胞的比例、凋亡率及Caspase-3蛋白表达均以浓度依赖性的方式明显增加。结论奥曲肽可显著抑制Huh-7细胞的生长,诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡;且奥曲肽可能通过启动Caspases途径诱导人肝癌细胞Huh-7凋亡。