斑腿蝗科Catantopidae七种蝗虫线粒体COⅠ基因的DNA条形码研究

以我国常见的斑腿蝗科Catantopidae7种蝗虫为对象测定了COⅠ基因序列,探讨COⅠ基因作为DNA条形码在识别蝗虫物种方面的可行性。结果表明,斑腿蝗科3属7种的DNA分类和形态学分类基本一致,该基因可以探讨蝗虫属、种分类单元的系统发育问题,为将线粒体基因组的COⅠ基因作为蝗虫DNA条形码进行分类鉴定手段的可行性提供一定的参考。

基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因序列的帘蛤科贝类分子系统发育研究

对21种帘蛤科贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit I,COI)基因核苷酸序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、分子系统发生研究中的应用价值。测序结果表明,所有物种扩增片段长度均为707 bp(含引物),序列A+T含量(62.4%—67.8%)明显高于G+C含量。物种间共有变异位点379个,其中简约信息位点334个;此区段共编码235个氨基酸,种间共有氨基酸变异位点100个。以COI基因片段序列为标记,用中国蛤蜊(Mactra chinensis)作外群,构建了35种帘蛤科贝类(其中14种贝类COI序列从GenBank下载)的系统发生树,结合拓扑结构分析和序列比对分析,结果表明:支持将短文蛤(Meretrix petechinalis)和丽文蛤(M.lusoria)订为文蛤(M.meretrix)的同物异名的观点,建议将丽文蛤和短文蛤订为文蛤的地理亚种;支持将薄片镜蛤(Dosinia corrugata)和D.angulosa订为2个独立种的观点;认为将波纹巴非蛤(Paphia undulata)和织锦巴非蛤(P.textile)订为2个独立种是合适的。COI基因序列含有丰富的遗传信息,适合作为帘蛤科贝类种群遗传结构和系统发生研究的分子标记。

嗜群血蜱和长角血蜱ITS-2、COⅠ和COⅡ基因序列变异与亲缘关系分析

本研究旨在阐明长角血蜱与嗜群血蜱间的亲缘关系。采用聚合酶链式反应(PCR)技术从长角血蜱和嗜群血蜱基因组DNA中扩增得到核糖体第二内部转录间隔区基因(ITS-2)片段、线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)片段和线粒体细胞色素氧化酶亚基II基因(COⅡ)片段,并进行测序,进而分析其基因变异与系统发育。结果表明,长角血蜱和嗜群血蜱的ITS-2、COⅠ和COⅡ基因片段的大小存在差异,长角血蜱3种基因分别为361、479和647bp,嗜群血蜱基因分别为354、474和661bp。长角血蜱与嗜群血蜱间ITS-2、COⅠ和COⅡ基因的相似性分别为84.2%、89.0%和88.4%。以3种基因构建的NJ进化树中,长角血蜱和嗜群血蜱均聚类。因此,认为长角血蜱和嗜群血蜱间ITS-2、COI和COII基因间变异较小,它们是血蜱属中亲缘关系较近的2个有效种,支持传统形态学的分类地位。

基于COⅠ基因的厦门海域鱼类DNA条形码鉴定

为研究DNA条形码技术在厦门海域鱼类分类鉴定中的可行性,随机选取了厦门海域23种鱼类样品进行COⅠ基因扩增,结果共获取23条序列,平均长度为656 bp,序列中T、C、G、A碱基的平均含量分别为:29.40%、28.10%、18.40%、24.10%.样品种内、种间、科内和目内的遗传距离(K2P)分别为:0.21%,20.50%、24.47%和25.62%,遗传距离随着分类阶元的提高而增大,种间遗传距离明显大于种内遗传距离.所选厦门海域鱼类样品仅蓝圆鯵鉴定到圆鯵属,未能鉴定到种,其余22种全部鉴定到种,表明COⅠ基因序列可以作为鱼类分类鉴定的有效DNA条形码.

黄鲷线粒体COⅠ基因部分序列遗传变异研究

对采自中国东海外海和日本海的黄鲷Taius tumifrons线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因进行了研究。利用通用引物对该序列进行了PCR扩增,去掉两端引物及部分序列共得到590bp的碱基片断,其中A、T、G、C平均含量分别为30.4%、24.3%、25.0%和20.3%,A+T(54.7%)高于G+C(45.3%)含量。在获得的9个序列中共发现有156个碱基存在变异,其中包括42处简约信息位点,没有发现碱基的插入和缺失,序列中的转换大于颠换。实验结果显示,个体间的遗传距离在0—0.223 6之间,c3和j3与其它个体相比遗传差异明显。2群体间平均遗传距离为0.089 7,而东海和日本海群体内的平均遗传距离分别为0.086 9和0.113 3,说明黄鲷个体间遗传差异较大,但群体间的遗传差异不明显。

青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)基因的克隆鉴定及表达分析

细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)是线粒体内呼吸链电子传递的终末复合物,是线粒体氧化能力的关键调节物质。细胞色素C氧化酶亚基I(COXⅠ)是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3个亚基之一。本研究以本实验室构建的青石斑鱼消减杂交cDNA文库中长587bp的EST序列为基础,采用RACE-PCR方法克隆鉴定出青石斑鱼(Epinephelus awoara)细胞色素C氧化酶亚基I基因。研究结果表明:青石斑鱼COXⅠ全长1659bp,5'端非编码区3bp,3'端非编码区105bp,开放阅读框1551bp,编码516个氨基酸。序列分析表明,青石斑鱼COXⅠ与线纹刺尾鲷COXⅠ同源性最高,达96.9%。采用半定量RT-PCR方法研究COXⅠ基因在青石斑鱼各组织中的表达特征,结果表明COXⅠ基因在正常的青石斑鱼和注射了副溶血弧菌灭活疫苗的青石斑鱼的脾、肝、心、头肾、肾、肌肉和鳃中都有转录表达。注射副溶血弧菌灭活疫苗后,除了鳃组织,其他组织中COXⅠ基因表达量较对照组都有显著提高(P<0.05),而鳃组织中的COXⅠ基因表达量没有显著变化。

栎黄掌舟蛾线粒体DNA COⅠ基因的碱基组成及系统进化分析

栎黄掌舟蛾(Phalera assimilis)是危害柞树的主要食叶害虫之一。克隆了栎黄掌舟蛾不同个体线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA COⅠ)基因5'端709 bp片段序列(GenBank登录号:KC573812～KC573814),通过与其它鳞翅目昆虫的同源序列比对,分析栎黄掌舟蛾mtDNA COⅠ基因序列片段的碱基组成及系统进化特点,从分子水平准确鉴定该柞树害虫。栎黄掌舟蛾及其比对昆虫的mtDNA COⅠ基因片段序列中,T、C、A、G 4种碱基的平均含量分别为39.8%、14.8%、30.9%、14.5%,密码子第3位点的A+T含量最高达94.2%,显著高于第1位点(59.9%)和第2位点(58.3%),碱基使用显著倾向于T(AT平均偏倚度为-0.125 9);在709 bp的序列片段中,16.36%为简约信息位点,4.51%为单突变位点,碱基转换略高于颠换,R值为1.2;不同昆虫mtDNA COⅠ基因序列间的平均遗传距离为0.054 1。克隆的栎黄掌舟蛾mtDNA COⅠ基因序列片段的T、C、A、G 4种碱基平均含量分别为38.7%、15.2%、31.3%、14.8%;所有样本的mtDNA COⅠ基因序列碱基替换数均与遗传距离呈显著线性关系。系统进化分析显示,栎黄掌舟蛾等掌舟蛾属(Phalera)昆虫与Datana属、Antheua属昆虫的亲缘关系最近,形成进化群Ⅰ,其它属种昆虫聚集形成进化群Ⅱ。研究结果表明,mtDNA COⅠ基因序列片段能作为DNA条形码将栎黄掌舟蛾与其它鳞翅目昆虫区分开。

基于COⅠ序列的DNA条形码在中国南海裸胸鳝属鱼类中的应用

为探讨中国南海裸胸鳝属(Gymnothorax)鱼类系统发育关系,采用DNA条形码技术测定了6种中国南海裸胸鳝的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因部分序列(504bp)。结合来自GenBank中的分布于日本和3种同样分布于中国南海的裸胸鳝属鱼类的相应同源序列进行比较分析,用邻接法和最大简约法构建分子系统树。结果表明:(1)504个位点中共有187个核苷酸位点存在变异(37.1%);(2)序列变异的转换/颠换比值平均为1.5;(3)细斑裸胸鳝(Gymnothorax fimbriatus)与黑斑裸胸鳝(G.favagineus)之间的同源序列碱基差异只有0.20%,支持二者是同种异名的观点;(4)在NJ树和MP树中,蠕纹裸胸鳝和网纹裸胸鳝聚为一支,位于系统树的基部位置。其余8种聚为另外一支,然后又细分为2个较小的分支。

洛阳地区9种嗜尸性丽蝇28S rRNA和COⅠ基因序列分析

目的评价9种嗜尸性丽蝇的细胞核28S核糖体核糖核酸(ribosomalribonucleic acid,rRNA)和线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunitⅠ,COⅠ)基因序列在常见嗜尸性丽蝇种属鉴定中应用的可行性,为推断死亡时间提供技术支持。方法收集洛阳地区常见嗜尸性丽蝇标本23只,经形态学鉴定后,提取腿部DNA,扩增并测序细胞核28S rRNA和线粒体COⅠ基因片段,通过BLAST搜索进行序列比对,并分析所得序列的碱基组成,建立种内及种间进化分歧率,用邻接法构建系统发育树。结果形态学鉴定23只嗜尸性丽蝇归属于5属9种。获得28S rRNA中715bp和COⅠ基因中637bp的序列,在线BLAST比对结果显示相似度达99%以上,系统发育树显示9种蝇类可以较好聚类,与形态学鉴定结果一致。28S rRNA基因序列的种内差异为0,种间差异为0.001～0.033;COⅠ基因序列的种内差异为0～0.008,种间差异为0.006～0.101。结论联合28S rRNA和COⅠ靶基因序列片段可以有效区分本研究中的9种嗜尸性丽蝇,但对于近缘种的判定需要更多遗传标记的开发和联合应用。

高氧对早产大鼠肺组织细胞色素氧化酶亚基Ⅰ表达的影响

目的探讨85%高体积浓度氧暴露对早产新生大鼠肺组织中线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)动态表达的影响。方法早产SD大鼠生后d2随机分为空气组、高氧组。高氧组持续暴露于85%氧气中,空气组置于同一室内常压空气中。两组分别于暴露满1、4、7、10和14 d时,提取肺组织RNA,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定COXⅠmRNA表达;采用免疫组织化学、免疫印迹(Western-blot)法检测COXⅠ蛋白表达。结果1.与空气组相比,高氧d1和d4 COXⅠmRNA的表达显著增强(P<0.05,0.01),其后开始下降,d7时两者无显著性差异(P>0.05),d10时较空气组显著降低(P<0.01),d14时又增高(P<0.01)。2.COXⅠ蛋白水平表达,与空气组相比,高氧d1和d4时,COXⅠ表达显著增强(P<0.01,0.05),d7时两者无显著性差异(P>0.05),其后开始下降,d10和d14时较空气组显著降低(P<0.01,0.05)。结论85%高体积浓度氧暴露诱导早产新生大鼠线粒体DNA编码COXⅠ异常表达,这种变化可能参与高氧肺损伤的发生。

基于线粒体COXⅠ基因变异探讨国内外猪种的遗传多样性及系统进化研究

基于mtDNA COXⅠ基因,探讨了6个猪种687个样本(大白猪、长白猪、杜洛克、藏猪、甘肃黑猪和八眉猪)的遗传多样性和各猪种间的亲缘关系。对各猪种样本mtDNACOXⅠ基因构建混合池,并利用直接测序技术获得6个猪种COXⅠ基因的序列,采用MEGA 6.0分析软件基于Kimurk双参数模型应用邻接法构建系统发生树。结果表明,6个猪种mtDNA COXⅠ基因序列共存在21个突变位点,其中8个突变为各群体特有。长白猪与杜洛克猪的多态性较丰富,含有13个相同位点的突变,核苷酸的转换数(si)和颠换数(sv)的比值(R)分别为12和15,序列替换远未达到饱和。而藏猪、黑猪和八眉猪的多态性较贫乏。系统进化树和遗传距离分析显示,6个猪种及野猪先聚为一支而后与同属为偶蹄目的牛、羊聚为一支,3个地方猪种间遗传距离较近。外来猪种引入中国后主要是用作父本以提高生产速度和瘦肉率等,对本地猪种未有母系贡献,线粒体COXⅠ基因可有效区别6个猪种的亲缘关系,在一定程度上为中国地方猪品种的有效保护和合理利用提供理论依据。

宁夏部分地区不同蚊种细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因序列分析

目的了解宁夏部分地区蚊虫种类组成和不同蚊种细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因特征和蚊虫分子系统进化关系。方法对宁夏银川市、石嘴山市、吴忠市和青铜峡市的三带喙库蚊、里海伊蚊、淡色库蚊和八代按蚊4种蚊种COI基因序列进行扩增、测序,在Gen Bank中对所测序列进行相似性比对,分析基因特征、颠换率、遗传距离,利用Mega 7.0软件构建分子系统树。结果本研究中相似性比对结果,其他蚊虫分别与其同种蚊虫的相似性均达到94%~99%,COI基因序列扩增长度为417 bp左右,GC含量为29.4%~31.5%,种间颠换率为5.80%~13.81%,种间遗传距离为0.121~0.160。结论 COI基因具有种间特异性,可作为不同蚊种分类鉴别的参考依据。

基于线粒体COⅠ序列比较长江口中华绒螯蟹放流与野生群体的遗传多样性

为探讨长江口中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)放流亲蟹与野生群体的遗传多样性和遗传结构的差异,对77个放流和野生亲蟹个体进行了线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列的比较分析,结果表明:所检测的样本共计77个COⅠ基因序列(630 bp)中,变异位点(V)41个,简约信息位点(P)37个,A+T(61.7%)的含量明显高于C+G(38.3%),表现出较为明显的碱基组成偏倚性;两个群体共检测出15种单倍型,其中单倍型Hap-1出现频率最大,为两个群体所共享,放流和野生群体各具有5种独有单倍型;两个群体的单倍型多样性指数(H)为0.825,核苷酸多样性指数(π)为0.004 66,平均核苷酸变异数(K)为2.910,其中野生群体的单倍型多样性指数(0.833)和核苷酸多样性指数(0.007 70)均高于放流群体(0.810和0.002 11)。AMOVA分子方差分析表明,长江口中华绒螯蟹放流与野生群体总的遗传变异主要来自群体内,其中96.53%遗传变异来自各群体内部,3.47%遗传变异来自群体间。群体内遗传分化指数(FST)野生群体(0.034 75)高于放流群体(0.034 57),两个群体间遗传分化指数(FST)为0.034 66(P>0.05),两个群体遗传分化不显著。两个群体间的基因流(Nm)为13.93(Nm>1),表明放流群体和野生群体的基因交流较为频繁。

基于线粒体COⅠ序列的中国前鳞(鱼夋)遗传多样性分析

前鳞(鱼夋)(Liza affinis)是分布于西北太平洋的日本南部及中国台湾海域等的经济鱼类。为了解中国前鳞(鱼夋)的遗传背景,该研究分析了采自中国4省82尾样本COⅠ基因5'端712 bp序列,共发现21个单倍型,遗传多样性(H_d=0.4840±0.0700,π=0.0010±0.0002)较低。根据群体所属的地区、海域、海峡进行分组,通过AMOVA分析,得出组间的Fst值皆小于0.05,P值皆大于0.05,组间变异的比例极低(–0.6%～0.46%),表明中国前鳞(鱼夋)群体间无明显分化,其原因可能是:1)频繁的基因交流。前鳞(鱼夋)的洄游范围较大,且受海流影响,导致不同地区的群体间有着密切的基因交流;2)近期种群扩张事件。中国前鳞(鱼夋)整体的Fu’s F_s值为显著性负值(F_S=–20.3900,P=0),核苷酸错配峰图为明显单峰,单倍型网络图呈星状结构,均表明中国前鳞(鱼夋)群体经历过种群扩张,估算扩张大约发生在13.4199～1.4911万年前,可能是冰期和间冰期的交替中海平面的变化所致。此外,洞头群体的遗传多样性(H_d=0.8080±0.1130,π=0.0021±0.0006)明显高于其他地理群体,建议将其作为优先保护的对象。

基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列的细胞种属鉴别及细胞交叉污染分析

目的建立一种快速、简便、敏感和特异的基于线粒体细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,CoI)基因序列的细胞基质检测方法,用于细胞种属鉴别和不同种属间的细胞交叉污染分析。方法①提取非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、狗肾细胞(MDCK细胞)和牛肾细胞(MDBK细胞)基因组DNA,以PCR扩增相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因条码序列,将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测其基因片段的大小,并与文献报道的来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守区的基因条码序列片段大小进行对比,以确定细胞的种属类别;②用Vero细胞、MDCK细胞和MDBK细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与相应细胞和其他不同种属的细胞的基因组DNA进行PCR扩增,检测方法的特异性;用不同浓度的细胞基因组DNA与相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物进行PCR扩增,检测方法的灵敏度;③以不同种属细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与多种细胞混合液提取的细胞基因组DNA进行PCR扩增,检测细胞间的交叉污染。结果 Vero细胞、MDCK细胞及MDBK细胞线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小,与来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小相符。该方法具备较好的特异性,检测灵敏度为1.0 ng/μL,不同种属间细胞的交叉污染可被检出。结论该方法可有效地判断细胞的种属来源,亦可用于不同种属间细胞交叉污染的分析。

生物分类学的新动向——DNA条形编码

过去的一年中 ,DNA条形编码 (DNABarcoding)成为生物分类学中引人注目的新方向。DNA条形编码 ,根据对一个统一的目标基因DNA序列的分析 ,达到物种鉴定的目的 ,它操作的简便性和高效性将以我们无法想象的速度加快物种鉴定和进化历史研究的步伐 ,但国际上对此的争论也不少。本文综述了DNA条形编码的原理、操作过程及最新进展 。

6种帘蛤科贝类及4个地理种群文蛤线粒体COI基因片段序列分析

对文蛤（Meretrix meretrix L.,1758）、青蛤（Cyclina sinensis G.,1791）、硬壳蛤（Mercenaria mercenaria L.,1758）、江户布目蛤（Protothaca jedoensis L.,1874）、薄片镜蛤（Dosinia corrugata R.,1850）和菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum A.,1850）6种帘蛤科贝类和4个地理种群文蛤（大连、连云港、湛江、防城港）的细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因片段的核苷酸序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、种群遗传结构和分子系统发生研究中的应用价值.测序结果表明,所有物种扩增片段长度均为709 bp,序列A＋T含量（62.2%-67.6%）明显高于GC含量.物种间共有变异位点311个,其中简约信息位点202个;文蛤4个地理种群间共有变异位点46个,其中简约信息位点2个.此区段共编码235个氨基酸,种间共有氨基酸变异位点85个;文蛤种群间只有1个氨基酸变异位点.以COⅠ基因片段序列为标记,用大竹蛏（Solen grandis）作外群,构建了帘蛤科贝类的系统发生树,其拓扑结构显示4个地理种群文蛤首先聚为1个单元,然后与青蛤聚在一起,最后所有帘蛤科物种聚为一枝,与外群相区别,其结果与传统形态分类基本一致,说明COⅠ基因适合作为该科贝类种群遗传结构和系统发生研究的分子标记.

利用线粒体DNA标记分析中国东南沿海拟穴青蟹种群遗传结构

为研究我国东南沿海拟穴青蟹(Scylla paramamosain)的种群遗传结构,对10个地理种群130只拟穴青蟹的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因片段序列进行分析。522 bp的DNA片段共发现17个变异位点,定义了21种单倍型,其中单倍型2为10个地方种群的共享单倍型,占个体总数的56.15%,而大部分单倍型为稀有单倍型,只在少数种群的个别个体中出现。10个种群的单倍型多样性水平为h=0.6738,核苷酸多样性水平为π=0.1987%,基本呈由南到北递减的趋势。10个种群的总体遗传分化程度较低(FST≈0.05),但是极为显著(P<0.005)。基于单倍型频率和序列遗传距离法分析的共同结果,广西北海种群与大多数种群的遗传分化显著,而海南三亚种群分别与海南红树林和广东台山种群遗传分化显著。Mantel检验显示种群间的遗传分化程度与地理距离没有显著的相关性。分子进化中性检验结果表明,自然选择在分子进化过程中起了重要作用,并暗示该物种在最近经历了一个快速的种群爆发及扩张事件。

两种鲷属鱼类线粒体COI基因片段序列的比较

利用通用引物成功扩增了黄鳍鲷和黑鲷的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因序列。通过序列测定，得到581bp的基因片段，碱基A、T、G、C平均含量分别为25．8％、32．6％、18．0％和23．6％，序列中的A＋T含量明显高于G＋C含量，与其他鱼类的C01基因片段研究结果相一致。通过序列分析发现黄鳍鲷和黑鲷两序列共存在14处碱基变异，其中在第19～139bp之间检测到13个变异位点，是变异频率较高的区段，可以考虑作为鲷属或者种群鉴别的分子标记。与黄鲷、真鲷、三长棘真鲷等鱼类比较，无插入和缺失位点，转换明显高于颠换。序列差异比较结果显示，真鲷与黄鳍鲷的序列差异在这5种鱼类中最大，达到了18．2％，黄鳍鲷和黑鲷的筹异最小（2．4％）。两个序列已提交到GenBank数据库中．序列臀录号为DQ185608和DQ185609.

DNA条形编码技术在动物分类中的研究进展

DNA条形编码(DNA Barcoding)技术是一种新的生物分类方法,它是分子生物学和生物信息学相结合的产物。这一概念认为,就像在商店里扫描仪读取条形码那样,对地球上每一种生物也能通过快速分析其DNA中的一小段(线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基,mt COI)加以识别。在最近3年里,该技术已成为生物分类学中研究的热点。理论上,DNA条形编码在生物分类鉴定中具有重要作用,但目前国际上对其的争论也不少。综述了DNA条形编码技术的产生、发展概况、原理与操作及其在动物分类中的应用,突出了该技术在寄生虫分类中应用的意义与可行性,并讨论了DNA条形编码在生物分类应用中可能存在的问题。