猪源肠球菌两种致病基因和表型的检测

为调查53株猪源肠球菌2种致病基因和2种表型的分布,应用聚合酶链反应检测53株肠球菌的2种致病基因,用50ml/L兔血平板和30g/L明胶平板检测β溶血和明胶溶解表型。检测结果表明,溶血素激活基因(cylA)明胶酶基因(gelE)为猪源肠球菌的主要致病基因;粪肠球菌2种致病基因和2种表型的检出率高于屎肠球菌;来源于新鲜猪肉中的粪肠球菌存在一定的致病力,提示注意食品卫生安全;在新鲜猪肉中检测到2株鸟肠球菌,基因型和表型检测说明其存在较弱毒力。

重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

目的:制备重组创伤弧菌溶细胞素(recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC)鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法:IPTG诱导含pET28a(+)-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型,ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果:将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经ELISA检测,血清有效稀释度达1:12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论:本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型。

创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定

目的制备创伤弧菌（Vibrio vulnificus）溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性，为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础。方法采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达，Ni—NTA亲和层析法提纯rvvhA，SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株，有限稀释法进行细胞克隆。采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型。采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性。结果在0．5mmol／LIPTG诱导下，rvvhA产量可占细菌总蛋白的18％。提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株，其中A5E8和C386株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体，其抗体类型分别为IgG1和IgG2a。A5E8和C386单克隆抗体有较高特异性，与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应，对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1：4000～1：8000、免疫双扩散效价为1：4～1：8，Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA。结论本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株，rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素。

创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定

目的克隆创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)溶细胞素基因(vvhA),构建原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性。方法采用PCR技术从Vv GTC333和WZ01株DNA中扩增全长vvhA基因,T-A克隆后测定其核苷酸序列。采用pET32a质粒构建vvhA基因原核表达载体,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rVvhA表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯rVvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot和兔抗rVvhA血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和免疫原性。结果所克隆的vvhA基因核苷酸序列与GeneBank公布的同源性分别为96.09%和98.26%。在0.5 mmol/L IPTG诱导下,rVvhA产量可占细菌总蛋白的18%。提纯的rVvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。重组蛋白rVvhA能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合,免疫家兔可获得高效价抗体。结论该研究成功地构建了创伤弧菌vvhA基因高效原核表达系统,所表达的rVvhA具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原。

创伤弧菌溶血素基因的高效表达与鉴定

目的:构建创伤弧菌溶血素基因(vvc)的融合表达载体,并实现创伤弧菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达.方法:用一对创伤弧菌溶血素基因特异性引物从创伤弧菌基因组DNA中钓取vvc基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET-32 a(+)-vvc融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物行SDS-PAGE并进行W est-ern B lot鉴定.结果:构建了pET-32 a(+)-vvc融合表达载体,DNA测序证明,获得的vvc基因长度为1311 bp,与Gen-Bank中报道的创伤弧菌溶血素基因序列完全一致.SDS-PAGE分析表明,vvc融合蛋白Mr为71×103,其表达量约占菌体总蛋白的32%.Western blot结果显示,目的蛋白可与创伤弧菌免疫后的小鼠血清特异性结合.结论:成功地实现了VVC基因在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究vvc蛋白的生物学功能奠定基础.

创伤弧菌溶血素蛋白的原核表达及纯化

目的构建创伤弧菌溶血素(Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)基因原核表达质粒,表达并纯化重组蛋白。方法从创伤弧菌基因组DNA中钓取VVC基因,插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白用镍离子金属螯合柱纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-VVC经双酶切及测序证明,VVC基因长度为1 371 bp,与GenBank中登录的VVC基因序列同源性为99%;表达的融合蛋白相对分子质量约为71 000,主要以包涵体形式表达,表达量达菌体总蛋白的50%;纯化的重组蛋白纯度大于90%,可与创伤弧菌免疫的小鼠血清特异性结合。结论已在大肠杆菌中高效表达了VVC蛋白,并进行了纯化,为创伤弧菌诊断试剂盒的研制提供了材料,也为进一步深入研究其结构功能域、生物学活性及创伤弧菌的致病机制奠定了基础。

重组金属蛋白酶蛋白的纯化及鉴定

目的构建创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)金属蛋白酶(vvp)基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性。方法采用pET-32a质粒构建vvp基因原核表达载体,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的重组金属蛋白酶蛋白rvvp表达,采用His-Ni亲和层析法提纯rVvp,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot鉴定其特异性和免疫原性。结果在1mmol/L IPTG诱导下,rvvp产量较高。提纯的rvvp经SDS-PAGE后仅显示分子量为86KD的单一蛋白条带。重组蛋白rvvp能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合。结论本研究成功地构建了创伤弧菌vvp基因高效原核表达系统,所表达的rvvp具有良好的免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原。

益生菌对耐万古霉素粪肠球菌V583杀伤效率及其分子作用机制

目的明确常见益生菌(屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌)对V583杀伤作用的最适条件及分子机制。方法利用细菌共培养技术,筛选对V583具有明显杀伤作用的益生菌;按照倍比稀释的方法,比较6~24 h内V583杀伤效率;通过基因组学比较的方式,明确不同杀伤效率的细菌基因组学差异,发现与V583杀伤密切相关的潜在分子机制。结果粪肠球菌对V583具有最佳杀伤作用;粪肠球菌与V583等量时可在6 h内,有效杀伤70%以上;比较基因组学研究表明:粪肠球菌的溶血素基因以及毒素-抗毒素系统(TA系统)与杀伤密切相关,可能发挥着关键作用。结论本研究通过比较不同益生菌对粪肠球菌V583的杀伤开展研究,发现了对V583发挥杀伤作用的最小菌量及可能的分子机制,对V583临床防治过程中益生菌的开发,有重要的指导作用。

水产品中创伤弧菌的分离、鉴定及毒性研究

通过溶血试验和小鼠急性毒性实验,评价市售水产品中创伤弧菌和标准创伤弧菌ATCC27562菌株毒性大小。从市售水产品中分离获得的6株疑似创伤弧菌菌株,经生化鉴定和溶细胞素基因扩增、基因测序后证实,除2号分离菌株基因测序未测出外,其它5株确定为创伤弧菌。创伤弧菌标准菌株ATCC27562菌株扩增出400 bp左右的基因条带,而6株分离株扩增出222 bp左右的典型创伤弧菌溶细胞素基因条带。在溶血试验中,创伤弧菌ATCC27562菌株的溶血圈与菌落直径之比达到3.0,1-6号分离株分别为2.3,2.0,2.8,2.0,2.5和2.1。在小鼠急性毒性实验中,创伤弧菌ATCC27562菌株的半致死量（LD50）是3.776×10^7CFU/m L,而3号分离株的LD50为2.218×10^8CFU/m L。创伤弧菌ATCC27562菌株为较强毒株,而3号分离株为弱毒株。