Alterations in the Cytoskeleton and Biological Behavior in Human Lung Cancer Cell Line L9981 by Nm23-H1 gene Transfection

Objective and Methods The key cause of failure to cure and high mortality in lung cancer. At present, it has been known

THE EFFECT OF db-cAMP ON THE GENE EXPRESSION OF CALMODULIN AND CYTOSKELETON IN THE TRANSFORMED CELLS

We have demonstrated that the distribution of microtubules (MT), mlcrofilaments (MF) and fibronectin (FN) were diminished, while the gene expression of the calmodulin and c- fos enhanced in the transformed C3H10T1/2 cells. After treatment with 1 mM db-cAMP for 1 hour and 2 hours, there was an early and repldly reduced in gene expression of Calmodulin and c-fos respectively. After db-cAMP treatment for 4 -5 days, the number of capping cells of ConA binding decreased significantly and the cell surface microvllll decreased as well. The growth of treated cells was inhibited markedly. By using 4F1 cDNA probe, which is preferentially expressed In G1 phase, we have found that the db- cAMP treated cells were accumulated at G1 phase. Of particular interest is the fact that the distribution of microtubules, mlcrofilaments and fibronectln were recovered after treatment with 1 mM db-cAMP for 6 days. It is suggested that the Inhibition of proliferation, alteration, of phenotype and reco- very of cytoskeleton is transformed cells after treatment with db-cAMP are related to the Inhibition of gene expression of Calmodulin.

亚砷酸钠染毒对酿酒酵母BY4742细胞骨架的影响

目的:利用酿酒酵母BY4742作为模式生物,探索不同浓度亚砷酸钠染毒后,细胞中砷的富集情况及对细胞生长和细胞骨架的影响。方法:分别以0.00 mmol/L、0.10 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L和2.00 mmol/L亚砷酸钠处理酵母BY4742细胞,通过液体培养法和斑点法检测酵母细胞生存情况,利用双通道原子荧光光度计检测细胞内砷含量。此外,利用鬼笔环肽对细胞骨架进行染色并观察,qPCR检测细胞骨架相关基因表达变化量。结果:在0.10 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L、2.00 mmol/L亚砷酸钠胁迫下,BY4742菌株生长受到不同程度的抑制,相对生长率显著降低为对照组的71%、63%、39%和6%。酵母细胞内砷含量随亚砷酸钠处理浓度的增加而增加,随着培养时间的延长细胞内砷排出胞外。此外,与对照组相比,以1.00 mmol/L和2.00 mmol/L亚砷酸钠进行染毒,细胞骨架出现斑块异常结构。以1.00 mmol/L亚砷酸钠进行染毒,arp2、arc15、arc19、arc18、las17、pfy1、cof1和crn1基因转录水平分别下调为对照组的59%、22%、28%、45%、28%、29%、35%和52%。结论:亚砷酸钠染毒后,砷在细胞内富集,抑制酵母BY4742菌株生长,抑制细胞骨架相关基因表达,导致其功能异常。

db-cAMP对转化细胞钙调素基因表达与细胞骨架的影响

转化的C_3H_(10)T_(1/2)细胞表现增殖速度加快、表面微绒毛增加,细胞变圆,叠层生长,ConA受体呈帽状分布,微管、微丝、纤粘蛋白分布明显减少。与增殖有关的癌基因c-fos表达增强,同时发现与细胞增殖、转化和细胞骨架调节有关的钙调素(CaM)基因表达加强。用1mmo/Ldb-cAMP处理转化细胞,观察到CaM基因和原癌基因c-fos的表达分别在处理后1小时和2小时急剧下降。处理后4—5天,转化细胞表型趋正常化,大部分细胞恢复单层生长。细胞表面微绒毛和泡状物减少,ConA受体帽状分布消失,恢复分散分布在细胞膜上的特点。细胞生长明显被抑制,用优先在G_1期表达的4F_1 cDNA为探针进行分子杂交,证实了经db-cAMP处理后的细胞被阻抑在G_1期。经db-cAMP处理6天的转化细胞中微管、微丝、纤粘蛋白基本恢复正常分布。实验表明CaM的表达增强与转化细胞表型变化和细胞骨架组装减弱密切相关,db-cAMP作用后CaM表达下降是抑制转化细胞增殖并使细胞表型和细胞骨架分布趋于正常的关键事件之一。

力达霉素对人肝癌bel-7402细胞凋亡基因表达和细胞骨架的影响

背景与目的:力达霉素是我所分离的烯二炔类抗肿瘤抗生素,因其独特的化学结构和对体内外肿瘤的强烈抑制作用,而倍受关注。除了断裂DNA外,力达霉素对细胞凋亡基因表达和细胞骨架的影响,可能与其高活性有关。本文通过观察力达霉素对人肝癌bel-7402细胞多指标的影响,进一步阐明其分子机制。方法:用Northernblot印迹法和dot印迹法检测癌基因表达,间接免疫荧光法检测微丝和微管,线粒体特异染料MitosensorTM检测细胞凋亡。结果:低浓度的力达霉素(0.1nmol/L)处理人肝癌bel-7402细胞8h,明显促进c-myc、c-fos基因表达,而抑制N-ras表达。10nmol/L力达霉素处理细胞8h后,细胞伸展,微丝排列整齐,向非恶性细胞转变,但对微管没有影响。用线粒体特异凋亡染料MitosensorTM检测发现,力达霉素处理8h后的细胞未出现凋亡,说明力达霉素引起肿瘤细胞凋亡首先需要诱导c-myc基因表达。结论:低浓度的力达霉素明显影响人肝癌bel-7402细胞的有关凋亡基因表达和细胞骨架的分布,这些结果有助于解释力达霉素高活性地作用肿瘤细胞的分子机制。

反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架的影响

为了研究反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架以及肿瘤细胞生物学行为的影响 ,以不同长度NGAL基因片段反义表达载体和硫代修饰反义寡核苷酸单链片段转染SHEEC食管癌细胞 ,通过G4 18筛选 ,建立一系列旨在封闭SHEEC食管癌细胞NGAL基因表达的亚细胞克隆 .在细胞内F 肌动蛋白 (F actin)及DNA荧光双标记基础上 ,通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜扫描术等技术手段检测封闭反义NGAL基因表达后 ,SHEEC食管癌细胞中F actin和DNA含量、F actin形态结构以及肿瘤细胞生物学行为的变化特征 .结果显示 ,反义封闭NGAL基因表达后 ,SHEEC食管癌细胞F actin的含量明显降低 ,与永生化食管上皮细胞SHEE相近 ,但细胞分裂增殖指数未见明显变化 .表明反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架有明显影响 ,而对SHEEC食管癌细胞的分裂增殖影响不明显 .激光共聚焦显微镜扫描观测显示 ,反义封闭NGAL基因表达可使SHEEC食管癌细胞F actin分布均匀 ,F actin小体减少 ,细胞间连接重新建立 ,结构较紧密 ,主要形态结构特征与SHEE细胞趋于一致 .提示反义封闭NGAL基因表达可对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架F actin产生明显影响 ,推测癌细胞的微丝骨架F

1,25双羟维生素D_3对成骨样细胞骨架和基因表达的影响

用荧光免疫法研究了１，２５双羟基维生素Ｄ３对大鼠成骨样细胞（ＲＯＳ１７／２．８）细胞骨架的影响和用斑点杂交技术研究了１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对人成骨样细胞（ＯＳ－７３２）基因表达的影响。结果表明：在１０－７ｍｏｌ／Ｌ１，２５（ＯＨ）２Ｄ３连续作用４ｄ后，大鼠ＲＯＳ１７／２．８细胞的微管蛋白和波形纤维蛋白明显改善，纤粘蛋白荧光明显增强。而在１，２５（ＯＨ）２Ｄ３作用前后ＯＳ－７３２细胞ｃ－ｍｙｃ和ｍｅｔＤ基因均处于高度活跃表达状态。本文还讨论了细胞分化与细胞骨架及基因表达的关系。

RNA干扰Rac1基因表达对结直肠癌LoVo细胞骨架和细胞周期的影响

目的:观察Rac1蛋白在结直肠癌细胞中的表达,并分析其与结直肠癌LoVo细胞骨架、细胞周期和细胞凋亡的相关性。方法:Western blotting测定5种结直肠癌细胞株(LoVo,SW480,SW620,SW1116,HT29)中Rac1蛋白的表达;Rac1-shR-NA质粒转染LoVo细胞后,激光共聚焦显微镜观察LoVo细胞骨架的变化,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化。结果:5种结直肠癌细胞株中均有Rac1蛋白的高表达。Rac1基因沉默后,LoVo细胞中交联状态的F-actin网明显减少且紊乱,G0/G1期细胞比例较对照组显著增加[(74.63±4.40)%vs(56.46±3.09)%,P<0.05],而S期细胞比例较对照组显著减少[(12.87±1.77)%vs(29.66±1.92)%,P<0.05];Rac1-shRNA转染组LoVo细胞凋亡率较对照组显著增加[(25.31±2.05)%vs(9.38±1.16)%,P<0.05]。结论:RNA沉默Rac1基因的表达影响了LoVo细胞骨架的形成和细胞周期,为以Rac1为靶点治疗结直肠癌提供了实验依据。

磷脂酶C分子在结核分枝杆菌触发树突状细胞细胞骨架重排中的作用

目的:研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)侵入小鼠树突状细胞株(DC2.4)时细胞骨架微丝、微管变化及其与磷脂酶C(PLC)分子的关系。方法:建立人结核分枝杆菌H37Rv株DC2.4细胞混合培养模型。采用罗丹明标记的鬼笔环肽(Palloidin-TRITC)染细胞F-actin,用抗微管蛋白β亚单位的小鼠一抗和荧光素标记的兔抗小鼠二抗染细胞微管,检测H37Rv株侵入DC2.4细胞时细胞骨架的变化情况,并计算F-actin重排率。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测DC2.4细胞浆和细胞膜中PLC分子的表达。采用PLC分子抑制剂U73122预处理DC2.4细胞,观察H37Rv株侵入率变化以及对细胞骨架变化的影响。结果:结核分枝杆菌H37Rv株与DC2.4细胞共育2 h,即见有细菌侵入,共育4、6、8、10、12 h后,H37Rv侵入率分别为(26.1±4.5)%、(39.9±5.6)%、(51.2±5.9)%、(57.9±6.1)%和(63.9±6.8)%;H37Rv侵入2、4、6、8、10、12 h时,F-actin重排百分率分别为(26.9±1.5)%、(59.3±2.8)%、(72.7±4.8)%、(78.2±5.9)%、(63.3±2.9)%和(43.2±2.6)%,而PLC信号分子阻断后,DC2.4细胞的侵入率则分别为(13.6±3.1)%、(14.2±3.9)%、(15.1±4.3)%、(16.8±4.0)%和(18.3±5.2)%,F-actin重排率也分别为(18.5±1.2)%、(22.3±1.7)%、(23.6±2.5)%、(24.8±2.3)%、(22.3±1.3)%和(23.8±1.8)%,而微管变化不大;混合培养4、6、8、10 h,PLC信号通路阻断前的侵入率和F-actin重排率明显高于PLC分子阻断后(P<0.05)。侵入2 h后,DC2.4细胞膜中的PLC分子表达即开始升高,至8 h时达最高;U73122可抑制DC2.4细胞膜中PLC分子的表达,而对细胞浆中的PLC分子影响不大。结论:结核分枝杆菌可通过激活DC2.4细胞PLC分子触发F-actin细胞骨架重排,从而侵入DC2.4细胞,且PLC分子的表达主要存在于DC2.4细胞膜上。

流体剪切应力对骨细胞分子活动的影响

机械应力在骨的生长、重建过程中起着十分重要的作用。应力刺激作用于骨组织后对应力感受细胞(骨细胞、成骨细胞)产生牵张应力及流体剪切应力(FSS)刺激,进而影响细胞内相关基因的表达,在此过程中流体剪切应力占主导作用。目前FSS引起骨细胞分子活动的具体机制还不明确,细胞膜上的应力敏感离子通道、整合素-细胞骨架复合体以及缝隙连接/CX43半通道结构可能在力学信号转导过程中起重要作用,它们可能通过促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen- activated protein kinase,MAPK)通路、蛋白激酶A/蛋白激酶C(PKA/PKC)通路、核因子κB(NFκB)通路、RhoA/Rho-激酶(RohA-dependent kinase,ROCK)通路以及Ca^(2+)通路起作用,最终影响细胞生长因子、转录因子以及成骨相关基质蛋白的表达。FSS影响骨细胞分子活动的应力传导以及信号转导的确切机制仍需要进一步阐明。

细胞肥大过程中hhLIM的亚细胞定位变化及其对细胞骨架的影响

hhlim (humanheartlim)是从人胎心cDNA文库中筛选克隆的一个新基因 ,作为LIM家族的新成员参与心肌肥大的发生发展过程 .为了进一步研究hhLIM在心肌肥大发生过程中的作用 ,以C2C12细胞为研究对象 ,以心肌肥大强效刺激因子内皮素 1(ET 1)为诱导因素 ,探讨hhLIM与肌动蛋白的相互作用及其影响细胞骨架的分子机制 .RT PCR、Western印迹和细胞免疫荧光分析结果表明 ,心肌肥大刺激因子ET 1在诱导心肌肥大标志基因BNP和肌动蛋白表达的同时 ,使hhLIM蛋白在C2C12细胞胞核与胞质之间进行重新定位 .激光共聚焦显微镜观察结果显示 ,hhLIM与肌动蛋白在胞质中共定位 .蛋白分步提取、鉴定及hhLIM与F肌动蛋白结合与沉降实验证明 ,hhLIM多存在于细胞骨架及其相关蛋白部分 ,在体外可与F肌动蛋白共结合 .这些结果表明 ,胞质中的hhLIM作为细胞骨架相关蛋白与肌动蛋白相互作用 .进一步研究hhLIM与细胞骨架的关系时发现 ,hhLIM过表达可使C2C12细胞的骨架变成致密网状纤维并使其对细胞松弛素导致的细胞骨架解聚产生一定的抵抗作用 ,抑制hhLIM表达则使细胞骨架稀疏 ,结构模糊 .提示hhLIM参与细胞骨架组织及重构的机制与其结合并稳定F肌动蛋白有关 .

应用酵母双杂交系统筛选与新基因nelin相互作用的蛋白质

目的 通过筛选能够与新基因nelin的心肌特异表达产物相互作用的蛋白质从而揭示nelin的生物功能。方法 构建表达nelin阅读框全长的诱饵质粒并利用酵母双杂交系统筛选人心脏cDNA文库, 以寻找与nelin蛋白发生相互作用的蛋白质。并利用生物信息学方法对筛选得到的蛋白质进行功能结构域分析。结果 筛选得到3 个蛋白质分别为肌联蛋白 (Titin ) N2B亚型, 细丝蛋白 (Filamin ) C亚型即γ Filamin和α胰蛋白酶抑制物重链前体 (inter alphatrypsin inhibitor heavy chain precursor, ITIH)。对这3种蛋白的C末端结构域进行分析发现Titin和Filamin均含有免疫球蛋白样结构域 (Ig- like domain)。结论 实验结果揭示了新基因nelin很可能表达一个细胞骨架相关蛋白, 它可通过其蛋白质的C末端同Titin和Filamin的免疫球蛋白样结构域发生相互作用而参与细胞骨架网络的形成。

细胞骨架在流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因和蛋白表达中的作用

目的:探讨细胞骨架在流体剪切力(FSS)诱导成骨细胞COX-2基因和蛋白表达中的作用。方法:将第3代小鼠原代成骨细胞分为4组:对照组、细胞松弛素D(CD)组、FSS组、FSS+CD组。FSS组和FSS+CD组分别施加12 dyne/cm2的FSS 60 min,FSS组只加FSS,而FSS+CD组在加入CD预处理60 min后施加FSS 60 min;对照组不做任何处理;CD组仅加入CD。应用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法和激光共聚焦显微镜检测COX-2 m RNA和蛋白的表达以及肌动蛋白细胞骨架的变化,并对结果进行双因素方差分析。结果:FSS组与其他3组相比,COX-2的m RNA和蛋白表达显著增加(P<0.05);CD组与对照组及FSS+CD组相比,COX-2的m RNA和蛋白的表达水平无显著差异(P>0.05);FSS+CD组与FSS组相比,COX-2的m RNA和蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。结论:应用FSS能使成骨细胞骨架发生重排、增多、增密且与流体方向保持一致。细胞骨架微丝的完整性与COX-2基因和蛋白表达密切相关,而CD对COX-2基因和蛋白的表达基本没有影响。

C-mer在增生性瘢痕中表达与意义

目的 原癌基因C mer与增生性病变关系密切。本研究探讨它在增生性瘢痕中所起的作用及意义。方法 收集瘢痕作为研究对象 ,利用原癌基因C mer的基因特异片段制成寡核苷酸探针 ,与瘢痕组织切片和成纤维细胞爬片原位杂交 ,统计学处理后分析其变化规律。结果 早期增生性瘢痕中C mer基因的探针在组织细胞中有较强阳性的反应 ,而非增生瘢痕则阳性反应较低 ,正常皮肤则更少。将增生性瘢痕与非增生瘢痕对比 ,二者差别特别显著。成纤维细胞爬片杂交结果存在相同的结果。结论 原癌基因C mer与瘢痕增生之间存在密切关系。同时 ,抑制该基因的表达 ,有望实现减轻瘢痕增生。

INF2基因在家族性局灶节段性肾小球硬化中的研究

新近发现INF2(inverted formin2)基因是常染色体显性遗传性局灶节段性肾小球硬化的主要致病基因之一,编码成蛋白家族成员INF2蛋白。INF2蛋白作为一种重要的肌动蛋白成核因子,可促进球状肌动蛋白向纤维状激动蛋白的转换,及细胞微管骨架的形成。肾小球足细胞作为是一种终末分化的细胞,对细胞骨架高度敏感。INF2可通过多条通路的共同作用,最终破坏足细胞骨架的正常结构及足细胞特异性相关蛋白的表达而致病。

RNAi沉默LIMK2基因对成骨细胞COX-2基因力学敏感性的影响

目的:采用RNAi技术沉默LIMK2基因来抑制细胞骨架改建,观察其对流体剪切力下成骨细胞COX-2基因力学敏感性的影响。方法;RNAi技术沉默原代小鼠成骨细胞LIMK2基因来抑制细胞骨架改建,分别用实时荧光定量巢式PCR和免疫荧光的方法检测流体剪切力下COX-2基因mRNA和蛋白的表达水平。结果:RNAi抑制细胞骨架改建可以促进流体剪切力诱导的成骨细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论:采用RNAi技术抑制细胞骨架改建,可以提高流体剪切力作用下成骨细胞COX-2基因的力学敏感性。

RNAi介导的IBP表达抑制对人乳腺癌MDA-MB-231细胞细胞骨架的影响

目的研究干扰素调节因子4结合蛋白(IBP)的表达抑制对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中微丝、微管的影响。方法设计并合成针对人IBP mRNA的RNA干扰(RNAi)序列,构建RNAi慢病毒表达载体,与包装质粒共转染人胚肾293FT细胞获得病毒颗粒,以病毒感染MDA-MB-231细胞。采用免疫印迹及实时聚合酶链反应(RT-PCR)确定能有效抑制IBP的RNAi序列,筛选出获得稳定感染的细胞株并进行微丝、微管染色。结果成功构建了IBP特异性的RNAi慢病毒表达载体和对照载体,对MDA-MB-231细胞IBP的沉默效率为69.9%;通过微丝、微管染色证实IBP表达下调后,细胞形态出现明显变化,细胞体增大,丝状伪足减少,片状伪足增多,微管排列紊乱。结论 IBP蛋白通过影响微管、微丝的排列而改变MDA-MB-231细胞生物学行为。

巨噬细胞与单核细胞的细胞骨架调控相关的差异基因表达

目的:分析单核细胞(Mo)向巨噬细胞(Mφ)分化的过程中,细胞骨架的调控相关基因及信号通路的表达变化。方法:CEO数据库获得Mo和Mφ的芯片数据,经RStudio软件分析获得差异表达基因(DEGenes),利用STRING在线工具对DEGenes构建蛋白质相互作用网络(PPI),Cytoscap软件筛选出DEGenes的核心模块;对筛选出的DEGenes的核心模块进行GO和KEGG分析。结果:Mφ相对于Mo的差异表达基因共476个,主要涉及的信号通路包括NOD样受体信号通路和吞噬体信号通路,这些通路中CCL18、CXCL8和C3等相关基因与细胞骨架的调控密切相关。结论:Mo向Mφ分化过程中细胞骨架调控相关基因的表达发生了显著改变。