Role of Deoxyribonucleoside Triphosphates(dNTPs)in Cell Transformation

Deoxyribenucleoside triphosphate (dNTP) pools were measured in normal BALB/c3T3 cells, transformation-treated cells and transformed cells with reverse-phase HPLC. The fluctuation of dNTP pools was similar after transformation treatment with alkylating mutagen glycidyl methacrylate(GMA) or Nmethyl- N'- nitro N- nitrosoguanidine (MNNG ). However,the gap between deoxyguanosine triphosphate + deoxyadenosine triphosphate (dGTP + dATP) pools and deoxythymidine triphosphate + deoxycytidine triphosphate (dTTP + dCTP) pools was greatly intensified. The measurements also indicated that the dNTP pools in transformed cells were quite different from those in normal cells. The results suggested that dNTP pools may play an important role in cell transformation

Role of dNTPs in Mutagenesis

The induced mutation frequency by alkylating mutagen glycldyl methacrylate (GMA) and N-methyl-N'- nitro- N-nitrosoguanidine (MNNG) was investigated with or without perturbation of deoxyribenucleoside triphosphate (dNTP)pools; the influence of short treatment at different concentrations of GMA or MNNG on dNTP pools was also explored. The results indicated that the induced mutation frequency increased greatly at high dosages of mutagen (GMA~ 64 μg/ml, MNNG~ 8 μg/ml) and the perturbation on dNTP pools was carried out before the treatment of mutagen; the short treatment with mutagen could induce distinct fluctuations of dNTP pools, but different mutagen might have different effects on dNTP pools.According to the results of the present study and other reports in literature, we conclude that dNTP pools may be the targets of alkylating mutagens and the fluctuations of dNTP pools are closely associated with mutagenesis

蛋黄果SCoT-PCR反应体系的建立与优化

为建立和优化蛋黄果SCoT-PCR反应体系,以“仙桃1号”蛋黄果为试材,SCoT1为引物,采用L_(16)(4^(5))正交试验,对影响SCoT-PCR反应的DNA、Mg^(2+)、dNTPs、引物及Taq聚合酶等因素进行优化;并选用3份地理位置相距较远的蛋黄果种质为模板,对优化反应体系进行验证。结果表明,不同因素对蛋黄果SCoT-PCR反应体系的影响存在差异,但不显著,其中最大的影响因素是Taq聚合酶含量,其次是dNTPs浓度、模板DNA含量、引物浓度和Mg^(2+)浓度。蛋黄果SCoT-PCR最佳反应体系(20μL)为模板DNA 80 ng、3 mmol/L Mg^(2+)、0.25 mmol/L dNTPs、0.4μmol/L引物、Taq 2 U。在该体系下,3份蛋黄果种质均能稳定扩增出清晰明亮、数目丰富且稳定性高的条带,说明优化的SCoT-PCR反应体系适用于蛋黄果SCoT分子标记。

脱氧核糖鸟苷酸对染色质松弛程度的调控作用

真核生物的染色质结构在基因转录、DNA修复等生物学过程中发生动态变化,其松弛程度和组蛋白修饰受到多种机制的严密调控.在研究DNA修复机制的过程中,发现敲除S期抑制基因(Spd1)可以逆转多种DNA损伤应答(DDR)突变体的表型缺陷,该遗传相互作用涉及到DDR的多个信号转导通路.Spd1的主要功能是抑制脱氧核糖核苷酸(dNTP)的生物合成,这说明敲除Spd1可以通过改变dNTP库的水平或组分来影响DNA损伤应答.进一步分析发现,Spd1缺陷促进染色质松弛,导致突变菌株的染色质对微球菌核酸酶的敏感,由此说明dNTP水平的增高可以促进染色质的紧密程度.最后,通过利用可以转运外源dNTP的FY2317菌株,制备原生质体,利用半离体的体系证明过量的dNTP,特别是脱氧核糖鸟苷酸(dGTP)可以模拟Spd1缺失菌株的表型,显著提高染色质的松弛程度.综上所述,研究发现了一种新的调控染色质松弛程度的遗传机制,可以影响DNA损伤修复的应答.

红景天属植物DALP反应体系的建立

目的 利用直接扩增片段长度多态(DALP)这一新分子标记技术建立一套稳定的红景天属植物的DALP反应体系。方法 以红景天基因组DNA为模板,对DALP反应程序的一些重要参数进行摸索和优化试验。结果 建立了一套稳定性强、可靠性高的DALP应用反应体系;经过大量重复性实验,反应体系为20μL,Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTPs浓度为1.25 mmol/L,模板DNA的量为60 ng,5 pmol/L选择性引物1μL,5 pmol/L反向引物3 μL,引物浓度比为1:3,Taq酶2 U。反应过程为:95℃预变性5 min、94℃变性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min;30个循环,再72℃延伸10 min,完成整个PCR反应。结论 该体系可有效地应用于红景天属药材的分类鉴定和地道性鉴定。

库尔勒香梨脉黄病毒RT-PCR检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料 ,对总RNA提取方法进行了研究 ,从中筛选出了适合库尔勒香梨总RNA的提取方法。结果表明 ,要获得良好的RT PCR扩增 ,RT体系中dNTPs浓度、互补引物、AMV、模板的浓度要分别达到 0 .1mmol·L-1、0 .2 μmol·L-1、0 .0 5U·μl-1、0 .0 1μg·μl-1以上。此外 ,使用RNasin能有效抑制RT体系中RNase对病毒RNA的降解作用 ,可使RT过程顺利进行 ;PCR体系中dNTPs浓度至少要达到 0 .1mmol·L-1,0 .2～ 0 .3mmol·L-1可以获得最佳的扩增效果 ;TaqE浓度要达到 0 .0 15U·μl-1以上 ;引物浓度适宜范围 0 .3～ 0 .7μmol·L-1;Mg2 + 要达到 1.2 6mmol·L-1以上。

小麦雄性不育材料RAPD扩增体系研究

以光敏雄性不育系A31及其恢复系1376为材料,使用美国MGREACHE公司生产的PTC-200型PCR,对影响RAPD扩增的因素进行了比较研究,确定了模板、Mg2+、dNTPs、引物和TapDNA聚合酶的适宜浓度和最佳的循环次数,实验结果表明在25μL反应体系中使用20～40ng的模板DNA,1.5～2.0mmol/L的Mg2+,0.3～0.4mmol/L的dNTPs,0.15～0.20μmol/L随机引物,1.0～1.5单位TaqDNA聚合酶;反应条件为94℃预变性5min,然后进行94℃45s,36°45s,72°90s,45个循环后,再在72℃延伸10min,小麦雄性不育材料RAPD扩增效果较好。

濒危竹种小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)RAPD-PCR反应体系优化

为了建立小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)RAPD-PCR反应的最优体系,以小蓬竹基因组DNA为模板,对影响其RAPD扩增的dNTPs浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、Mg2+浓度等重要参数进行了单因子和正交试验。试验得出小蓬竹RAPD最优反应体系为:20μL反应体系,10×PCR buffer为1/10体积,dNTPs为100μmol·L-1,模板DNA量为30 ng,Taq DNA聚合酶为1.0 U,引物浓度为0.2μmol·L-1,Mg2+浓度为1.5 mmol·L-1。优化后的RAPD-PCR反应程序为:94℃预变性5 min,然后进入35个循环,即94℃变性1 min,35℃退火30 s,72℃延伸90 s,循环完毕后于72℃延伸7 min,最后在4℃保持。

利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对水曲柳ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,PCR结果用统计软件MINITAB分析:①各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Taq酶量影响最大;②筛选出各反应因素的最佳水平,建立水曲柳ISSR-PCR反应的最佳体系(20滋l)为:Taq酶1.0U,Mg2+2.0mmol/L,模板DNA50￣200ng,dNTP0.15mmol/L,引物0.3滋mol/L。最后,对水曲柳ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为58.3℃。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术,研究水曲柳的地理变异提供一个标准化程序。

影响小麦RAPD稳定性的试验技术研究

随着 PCR和 RAPD技术在生物学领域的广泛应用 ,人们在实验中遇到的问题也越来越多 ,其中RAPD的可重复性差是最主要的一个问题 ,也是该技术最难克服的缺点。作者在利用 RAPD技术标记进行小麦的抗病毒基因研究中 ,对影响扩增结果的模板、底物、引物和扩增程序等进行了实验探索 ,结果表明 :模板的浓度、d NTP浓度、引物浓度及反应程序均对 RAPD扩增结果有明显影响。

在多基因PCR中对dNTP与Mg^(2+)的浓度关系的研究

目的 通过实验介绍在单一浓度下的Mg2 + 与在不同浓度情况下的dNTP及在单一浓度下的dNTP与在不同浓度下的Mg2 + 进行多基因PCR的反应过程。方法 通过多基因PCR分析比较Mg2 + 和dNTP在不同浓度下的反应结果。结果 PCR反应在 10×PCRBuffer为 0 0 2mol/LMg2 + 浓度时 ,随着dNTP浓度的增大 ,PCR反应增强 ,特别是较大片段PCR产物反映更为明显。但随着dNTP浓度的继续增大 ,PCR反应抑制 ,扩增条带度减弱 ,直至条带完全消失。而在0 0 0 2mmol/LdNTP浓度下 ,随着Mg2 + 浓度的不断增大 ,反应逐渐增强。但随着Mg2 + 浓度的继续增大 ,扩增条带亮度有减弱趋势。结论 在Mg2 + 单一浓度下 ,较大浓度dNTP有增强条带亮度的作用 ;在dNTP单一浓度下 ,过高的Mg2 + 浓度能抑制反应。

端粒酶活性检测方法的改进及dNTP浓度对端粒酶活性的影响

利用重新设计的引物和反应步骤 ,对检测端粒酶活性的 TRAP反应进行了改进。与原有方法相比 ,新方法在PCR扩增过程中不改变端粒酶产物的长度和比例 ,能更准确地反映端粒酶反应产物的性质。利用这个方法 ,考察了d NTP浓度对端粒酶的影响 ,发现不同的脱氧核苷酸对端粒酶活性的影响有差异。

乌拉尔甘草ISSR-PCR反应体系优化研究

甘草是中国最大宗的药材之一,具有重要的药用、生态及工业价值。利用ISSR技术对甘草种质资源的遗传多样性进行深入研究,对甘草物种生物多样性的保护及新品种培育具有重要意义。研究了影响甘草ISSR-PCR扩增效果的一些因素,实验结果表明:最适宜用于甘草ISSR+PCR分析的反应条件为:20μl反应体系中,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10mmol/LTris-HCL,pH9.0,50mmol/LKCL,0.1%TritonX_100,2.0mmol/LMg2+),0.8UnitTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,200μmol/LdNTP,10ng模板DNA。

烟草RAPD反应体系的建立与优化研究

以烤烟品种为材料,研究了烟草RAPD分析过程中的影响因素,包括模板浓度、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、循环次数、退火温度等,建立了适于烟草RAPD分析的PCR反应体系:即在25μl反应体系中,模板用量为40ng;引物浓度为0.4μM;Mg2+浓度为2.5mM;dNTP浓度为0.2mM;TaqDNA聚合酶用量为1U。扩增程序为94℃预变性5min;然后94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸1.5min,39个循环;最后72℃延伸5min。

基于CEQ遗传分析仪的AFLP条件的优化试验

对AFLP选择性扩增反应的dNTP和MgCl2浓度进行了优化试验,产物检测与分析在CEQ遗传分析仪上进行。结果表明:在0．2mMdNTP和2．0mMMgCl2的条件下获得的扩增结果最佳,即AFLP条带最多,毛细管电泳的信号强度最高。

dNTP库与细胞转化间关系的研究

采用反相ＨＰＬＣ法定量测定了ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３细胞经烷化突变剂甲基丙烯酸环氧丙酯（ＧＭＡ）和Ｎ－甲基－Ｎ′－硝基－Ｎ－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）转化处理后胞内脱氧核糖核苷三磷酸含量（ｄＮＴＰ库）的变化及最终形成的Ⅲ型转化细胞中的ｄＮＴＰ库，发现转化处理后ｄＮＴＰ库的变化规律相似：均表现为脱氧嘌呤核苷三磷酸库与脱氧嘧啶核苷三磷酸库间差距明显扩大；转化细胞中ｄＮＴＰ库也明显异于正常细胞，提示ｄＮＴＰ库可能在细胞转化进程中起着重要作用。

mRNA差异显示技术的研究进展

针对mRNA差异显示技术中的假阳性高和放射性污染等缺陷,文章从改进引物设计、应用非放射性标记、优化PCR参数、假阳性鉴定等方面进行了综述。1采用4种兼并或单碱基引物作锚定引物;用特异和长序列(≥20bp)专一性引物作为随机引物,可增加特异性;在锚定引物之前加上了一段T7启动子序列,在随机引物前加上一段M13重复序列,可使DDRT—PCR的体系的扩增特异性更一致。2针对放射性同位素检测法的缺点,文章提出并比较了几种常用的非放射性同位素标记方法。3保证起始(模板)mRNA质量和浓度,降低dNTP浓度,选择最适的反转录和PCR退火温度,可优化PCR参数。4用两种不同的反转录酶进行反转录平行实验,很容易区分出RNA制备过程中造成的假阳性,目前假阳性鉴定大多还是以Northern印迹为基础,再作些适当的改进。

新疆野生啤酒花DNA提取及RAPD反应体系的建立

采用 2种方法提取啤酒花的基因组DNA ,并分析了样品的不同状况和是否纯化对所提DNA质量及其RAPD扩增效果的影响。结果表明 :采用改进的高盐低pH法优于CTAB法。以此法所提DNA为模板进行随机扩增多态DNA(RAPD)试验 ,分别测试了Mg2 +、dNTP、Taq酶、模板DNA浓度和退火温度对反应结果的影响 。

利用正交设计优化辣椒的SRAP反应体系

以辣椒雄性不育保持系B-07LP为试材,利用正交设计L16(45)在5个水平上对影响辣椒SRAP反应体系稳定性的dNTP浓度、引物用量及Taq酶活性浓度梯度等外部条件进行了优化试验。在此基础上,通过单因素完全随机试验确定了辣椒SRAP关键反应因子的适宜浓度。其中引物浓度为0.4μmol/L、dNTP的适宜浓度为0.2 mmol/L及适宜的Taq酶活性浓度为0.3 U/μL,并对所建体系的稳定性进行了验证。

梨树RAPD分析条件的优化

以黄花梨为试材,建立了梨树RAPD分析的优化反应条件,即25μL反应体系中含有Tris-HCl(pH9.0)10mmol/L,KCl50mmol/L,MgCl22.0mmol/L,dNTP200μmol/L,模板DNA10ng,引物400μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U.适宜的扩增程序为94℃120s,1个循环;94℃60s、37℃75s、72℃120s,45个循环;72℃10min,1个循环.