基于SVM的高通量dPCR基因芯片荧光图像分类研究

目的为了实现高通量dPCR基因芯片荧光图像的亮点分类与计数,提出一种基于支持向量机(SVM)的荧光图像分类与计数方法。方法首先对荧光图像进行去噪、对比度增强等图像预处理,对预处理后荧光图像进行亮点区域提取标注,去除背景与暗点的冗余信息,利用方向梯度直方图(Histogram of Oriented Gradient,HOG)提取鉴别特征,计算合并所有样本的亮点特征得到HOG特征向量,根据已得到的HOG特征向量创建一个线性SVM分类器,利用训练好的SVM分类器对荧光图像亮点进行分类与计数。结果对比传统算法,文中算法具有较高的分类识别精度,平均准确率高达98%以上,可以很好地实现荧光图像亮点分类与计数。结论在有限的小样本标注数据下,文中算法具有良好的分类性能,能够有效识别荧光图像中的亮点,对其他荧光图像分类研究也具有一定参考价值。

多特征融合高通量dPCR荧光图像识别

传统高通量dPCR荧光图像分析结果易因假阳性点与非特异性扩增而导致阳性点识别率较低,因而本文提出一种多特征融合高通量dPCR荧光图像识别方法(HDFINet),以提高阳性点识别准确性。首先,在特征融合部分引入自上而下结构,使得下层特征在顶层被更有效地利用。在自上而下结构中,使用通道注意力来分配荧光图像通道权重,并使用空间注意力来分配特征图中荧光图像像素相应权重,使得特征映射能够更好地响应荧光图像特征。然后,在RPN中使用自适应交并比IOU计算阳性点包围框置信度,减少阳性点信息丢失可能性。最后,ROI Align将荧光图像候选区域中阳性点特征重新固定尺寸后,输入至全连接层和全卷积层,进行类别与回归框回归,输出阳性点识别结果。本文提出的HDFINet网络具有较高识别率,可以有效地实现荧光图像阳性点识别,与YOLOv4、VF-Net、GROIE相比,本文方法综合指标F1最高,相比于经典的深度学习网络Mask R-CNN网络,本方法对阳性点识别真阳性率提高了1.13%,阳性预测值提高了0.36%,综合指标F1的值提高了0.75%。本文提出的HDFINet网络具有良好的识别性能,能够有效识别荧光图像阳性点,对其他荧光图像分析研究具有参考价值。

改进的K-Means高通量dPCR荧光图像分类算法

目的 为实现高通量dPCR荧光图像阳性点高精确度分类,提出一种改进的K-means高通量dPCR荧光图像分类算法。方法 首先,将预处理后的荧光图像进行像素灰度值统计,依据图像亮度自适应选择波峰波谷作为聚类中心,通过马氏距离度量确定像素簇类;然后,将粗分类结果进行开、闭运算及删除小面积对象等形态学处理;最后,利用3次连通域统计方法完成细分类、位置标识和计数。结果 选取4种通道825幅荧光图像进行检验,平均精确率达到99.06%,召回率达到98.97%,分类效果良好。结论 文中提出的改进K-means分类算法可以实现对高通量dPCR荧光图像的高精度分类和计数,对其他荧光图像分类识别具有一定借鉴意义。

应用于dPCR基因芯片的荧光精缩无限远物镜设计

数字聚合酶链式反应(dPCR)技术在生物医疗领域具有非常重要的应用价值,为了进一步投入临床诊断和病原体检测中需要在光学检测系统的检测效率和准确性方面取得进展。针对dPCR检测需求,使用ZEMAX软件设计了无限远消色差荧光精缩物镜。镜头物方数值孔径为0.1,整体放大倍率为-0.65倍,可对Φ为34.9mm的物体进行成像,物方工作距离105.3mm,像方传递函数在70lp/mm处高于0.73,相对畸变小于0.4%;镜头设计可以同时满足大视场高分辨率的荧光多通道探测要求;基于无限远荧光显微成像技术,镜头可一次性检测位于28mm×18mm基因芯片上2万个反应通道,克服现有设备拼接成像的弊端并提高检测效率。

一种高通量dPCR荧光图像自适应增强算法

目的为了改善荧光图像背景光照不均匀和对比度低的问题,提出一种荧光图像自适应亮度校正和低对比度增强算法。方法根据光照成像原理,利用引导滤波提取出荧光图像的光照分量,通过改进的二维Gamma函数动态校正背景光照,利用Top-hat变换分离出校正后的前景和背景,对前景进行自适应直方图均衡化,以实现荧光图像自适应增强的目的。结果对比传统算法,文中算法处理后的图像背景光照均匀,对比度增强效果明显,其中标准差平均提高了9.4倍,平均梯度平均提高了1.2倍,信息熵平均提高了0.2倍。结论文中算法可以改善高通量dPCR荧光图像背景光照不均匀性,提高图像对比度,突出图像中隐藏的细节,对其他荧光图像处理也具有参考价值。

转基因大豆MON87701品系qPCR和3D-dPCR检测方法的建立

转基因大豆MON87701是由孟山都公司研发的商业化抗虫大豆品系,目前已在17个国家广泛应用。为建立适用于MON87701大豆的高效检测方法,本研究基于实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitive PCR, qPCR)和芯片式数字PCR(3D digital PCR, 3D-dPCR)平台,对44种不同转基因材料进行测试,建立双重定量检测方法。研究结果显示:只在转基因大豆MON87701样品中获得了阳性结果,证实该方法中引物和探针组合具有较高的特异性。进一步对2%、0.9%、0.09%和0.02%不同含量的MON87701转基因大豆进行定量测试,建立的qPCR和3D-dPCR两种方法的定量限均达到0.09%,检出限均达到0.02%,两者并无明显差别,但由于3D-dPCR和qPCR相比不需要标准物质制作标准曲线,并且对DNA提取质量要求更低,因此使用起来更加便捷高效,为转基因检测提供了新的方法和思路。

高通量dPCR基因芯片荧光激发测控系统的研制

为了解决高通量数字聚合酶链式反应(dPCR)基因芯片荧光激发问题,设计了一套荧光激发测控系统。系统根据荧光染料的激发光谱特性,选择大功率窄带LED作为荧光激发光源,并通过STM32微处理器系统进行控制。该荧光激发系统有FAM、HEX和ROX三个荧光激发通道,各通道LED激发功率能够分别调节。系统最大输出电流为8 A,单通道最大输出功率为3 W,调节精确度<1.0%,系统一次可完成dPCR基因芯片9 600个微液滴的荧光激发和采集。测试实验结果表明,系统达到了设计指标和应用需求。

禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用

为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系;利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验;采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明,成功建立了一种同时检测H7亚型(723 bp)和N2亚型(314 bp)AIV的nano-dPCR方法,该方法特异性良好,其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带,H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL,其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍,其对临床样品检测结果准确率达到100%,可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。

基于免扩增高通量测序的转基因定量检测方法研究

转基因定量检测在食品安全监管和消费者知情权保障中扮演着重要角色。当前,数字PCR方法被广泛认可为核酸精准定量的黄金标准,但缺乏与之相互验证的新型核酸定量技术,这在一定程度上限制了其应用。然而,近年来高通量测序技术的兴起为解决这一难题提供了新的可能性。尽管高通量测序技术主要用于核酸定性序列测定,但其在核酸定量领域的应用潜力尚未充分挖掘。以含有转基因T-NOS、P-35S、CP4-EPSPS和大豆内标准基因Lectin的质粒DNA标准物质为检测对象,采用免扩增建库的方法,比较了NGS、三代测序以及数字PCR定值的差异。结果表明,NGS测序结果与数字PCR结果存在显著性差异,这一发现突显了目前核酸定量技术中的挑战和需求。然而,值得注意的是,三代测序结果与数字PCR检测结果一致性良好,显示了其作为转基因核酸精准定量方法的潜力。这一发现为未来转基因产品标识阈值的制定提供了技术上的支撑和参考,为食品安全监管提供了新的技术途径。

数字PCR技术的发展和应用

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术作为一种全新的核酸检测方法,通过把反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量。目前dPCR主要分为微滴式和芯片式两种。与传统PCR技术相比,dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点。因此,dPCR技术在近年来得到了迅速的发展,广泛地应用于稀有突变检测、拷贝数变异分析和复杂样本基因表达检测等方面。

数字聚合酶链式反应技术在食品安全核酸检测中的研究进展

数字聚合酶链式反应(Digital Polymerase Chain Reaction,dPCR)技术是一种新兴的核酸绝对定量分析技术,无须标准品和绘制标准曲线,通过极限稀释样品和泊松概率分布原理就可以精准检测样本初始的DNA拷贝数,具有特异性强、灵敏度高和重复性好的特性,在食品安全核酸检测领域具有较好的发展潜力。本文介绍了dPCR技术的基本原理和特点,分析了dPCR技术在食品安全核酸检测领域的研究现状,并对其在食品安全中的应用前景进行展望,以期为促进dPCR在食品安全核酸检测领域中的应用提供一定参考。

马病毒性动脉炎病毒数字PCR方法的建立

在马病毒性动脉炎病毒(EAV)基因组序列的高度保守区域ORF7上设计引物和探针,对反应体系中的条件进行优化,验证其灵敏性、特异性、重复性,建立了马病毒性动脉炎病毒数字PCR方法(digital PCR,dPCR)。结果显示,建立的EAV数字PCR方法在退火温度为58℃、引物终浓度为0.9μmol/L和探针终浓度为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;该方法与马泰勒虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒均无交叉反应;最低检测限为0.16 copies/μL;组内及组间变异系数均在2.5%之内;通过对234份临床样本进行dPCR检测,阳性检出率为15.81%,高于实时荧光RT-PCR方法检出率(14.1%)。结果表明,建立的dPCR能快速、精准定量EAV在样本中的病毒载量,可用于马病毒性动脉炎病毒的早期检测。

脱氧核糖核酸定量的潜在基准方法研究进展

脱氧核糖核酸定量分析是食品安全检验、医疗诊断、转基因检测与病原微生物鉴定等相关领域的基础。常见的定量方法种类繁多,如紫外分光光度法、荧光染料法和实时荧光定量PCR法等等,各有所长,但测量结果缺乏可靠性、可比性和一致性。随着研究的深入与应用要求的提高,基准方法成为了核酸分析以及核酸测量能力评估的关键。本文综述了近年来三种成为潜在脱氧核糖核酸定量基准方法的研究发展,评述了各种方法的技术优势、不足与应用潜力,以期为其相关研究和利用提供参考。

马疱疹病毒1型QuantStudio^TM 3D数字PCR检测方法的建立

试验旨在建立一种高灵敏性的马疱疹病毒1(EHV-1)3D数字PCR(3D-dPCR)检测方法,对EHV-1病毒含量较低的样品能准确定量检出,实现马鼻肺炎早期诊断及预防。根据EHV-1糖蛋白B基因保守区域设计特异性引物和探针,优化3D-dPCR反应体系中引物探针浓度和退火温度,对该方法进行灵敏性、特异性、重复性分析,建立了EHV-1的3D-dPCR方法。本研究建立的3D-dPCR方法,引物和探针最佳浓度分别为0.4和0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃,该方法绝对定量曲线的R2=0.998,线性关系良好,与实时荧光定量PCR方法相比灵敏度高10倍左右,最低检出限为5.83拷贝/μL;批内和批间重复性试验变异系数均<3.2%;与EHV-4、马泰勒虫、马病毒性动脉炎的核酸无交叉反应;通过对123份临床样品进行3D-dPCR检测,结果显示,3D-dPCR方法阳性检出率为66.7%,高于世界动物卫生组织(OIE)中EHV-1的实时荧光定量PCR方法阳性检出率64.2%。3D-dPCR方法对病毒含量较高的样品与实时荧光定量PCR结果一致,对病毒含量较低的样品敏感性更高,能有效检出可疑样品。本试验结果表明,建立的3D-dPCR方法检测低拷贝数的临床样品时灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于EHV-1的准确定量检测。

基于图像拼接的高通量数字PCR荧光基因芯片读取系统的设计

针对高通量数字聚合酶链式反应荧光基因芯片检测的需求,提出了一种基于荧光显微光学技术的基因芯片检测系统。系统以无限远荧光显微系统为框架,通过制冷CCD一次完成较大视场的成像,顺序移动基因芯片得到全部图像,通过图像拼接完成检测,切换二向色镜组实现检测不同荧光通道的目的。光学系统分辨率可达16.3μm、曝光时间500ms,目前只需要拼接35次,即可在1min内完成对28mm×16mm的基因芯片内两万多荧光通道的检测,极大的提高了检测效率。

动物疫病研究新方法——数字式PCR技术

本文论述了数字式PCR技术的原理和发展过程,比较了不同数字式PRC技术的特点,展望数字式PRC技术应用于动物疫病研究中。

数字PCR在几种常见人类传染病研究中的应用

聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)是现代分子生物学的基础,被广泛应用于核酸的定性及定量分析,是人类传染病病毒核酸分析的核心技术。数字PCR(digital polymerase chain reaction,d PCR)作为一种新兴的核酸定量分析技术,具有高精确度、高精密度等优点。它打破了传统实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)技术的局限,不依赖于标准曲线,直接检测样本中靶片段的拷贝数,是一种更为简单且实用的核酸绝对定量分析技术。本文就近几年该技术在人类传染病病毒核酸定量分析方面的研究进行概述。

数字聚合酶链式反应技术在食品安全检测领域的研究应用进展

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)作为一项新兴的基于单分子目标基因扩增的绝对定量技术,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文综述了商业化dPCR技术在转基因成分、动物源性成分、食源性致病微生物定量检测等食品安全领域的研究进展,讨论了dPCR应用中技术难题的解决,并在此基础上展望了该技术在食品安全检测领域的发展前景。

双重PCR检测携带有tl和tdh基因的副溶血弧菌毒力菌株

在常规PCR技术的基础上优化条件 ,建立并完善双重PCR技术 ,并通过检测阳性对照和待检样品 ,进一步确定其检测的可行性。结果表明在常规PCR方法中为阳性的样品 ,包括阳性对照以及待检样品 ,在双重PCR方法中也呈现阳性 ,为阴性的样品在本方法中则也呈现阴性 ;能在血平板中出现溶血圈的在本法中也被印证含有tdh基因。由此证实本方法确实能对tl和tdh两种基因同时进行检测 ,成功地证明了同时检测tl和tdh两种基因的双重PCR方法的可行性。该法不但具有常规PCR的优点 ,而且还能节省耗材和时间 。

数字PCR方法准确测量质粒DNA拷贝浓度

中国计量科学研究院(NIM)利用数字PCR技术针对国际比对样品质粒DNA,通过设计2对特异性的引物和探针、优化PCR扩增体系、排除PCR mastermix中的DNA污染,成功建立了定量该质粒DNA的数字PCR方法。比较了采用单重PCR和双重PCR方法定量结果之间的差异,最终实现了对比对样品的定量和不确定度评定。对线性质粒样品的测量结果及其扩展不确定度(k=2)为(8.06±0.55)×10~3 copies/nag,该结果在比对参考值不确定度范围内,且与参考值非常接近。