人细胞核dUTPase的克隆表达及其酶学活性

以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dUTP焦磷酸酶 (dUTPase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表达的融合蛋白GST dUTPase经过谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,凝血酶酶切和SephacrylS 10 0纯化 ,得到高纯度dUTPase蛋白 .通过SDS PAGE ,氨基酸组成分析 ,N端氨基酸序列测定以及HPLC测Mr 结果与期望值一致 .通过检测该酶水解dUTP释放的焦磷酸 (PPi)来测定表达产物dUTPase蛋白及GST dUTPase融合蛋白的酶活性 ,发现两蛋白都具有正常的酶水解dUTP活性 ,但融合蛋白的活性比dUTPase蛋白低 7～ 8倍 .同时研究了Mg2

金属硫蛋白-3对dUTPase调节dUTP细胞毒性作用的影响

金属硫蛋白 3(MT 3) ,又称神经生长抑制因子 ,是一种脑特异性金属硫蛋白。人细胞核dUTP焦磷酸酶(dUTPpyrophosphatase,dUTPase)是最近在脑中研究发现的能与人金属硫蛋白 3(humanmetallothionein 3,hMT 3)相互作用的一个蛋白 ,两者共同作用具有神经元生长抑制活性。为了探讨hMT 3对dUTPase调节dUTP引起的细胞毒性作用的影响 ,通过基因转染HEK2 93细胞观察细胞在dUTP中的生长情况 ,发现共转染hMT 3和dUTPase基因的细胞比单转染dUTPase或hMT 3基因的细胞具有更强的对dUTP细胞毒性的耐受能力 ;同时在大肠杆菌BL2 1中表达重组蛋白 ,测定hMT 3在dUTPase水解dUTP中的作用 ,结果显示重组蛋白hMT 3可以促进dUTPase对dUTP的水解。结果均初步证实了hMT 3对dUTPase抵抗dUTP引起的正常细胞死亡有一定的协同作用 ,为进一步研究dUTPase及其相互作用蛋白hMT 3在化疗中的应用提供理论依据。

急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co2+柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg2+可以增强其活性。

猪囊尾蚴dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

【目的】克隆、表达猪囊尾蚴dUTPase基因并分析其酶学活性。【方法】通过RT-PCR的方法克隆猪囊尾蚴dUTPase基因,将其与pET载体连接并在原核系统中高效表达;表达产物经Ni柱纯化后进行酶学活性测定。【结果】序列分析表明猪囊尾蚴dUTPase基因与六钩蚴的dUTPase基因核苷酸同源性为100%,而且其氨基酸序列中同样存在5个保守基序。SDS-PAGE显示在21kD附近出现与目的蛋白大小相符的特异条带,表达产物经纯化后dUTPase的含量为2.863mg·mL-1。酶学活性试验证实重组dUTPase能特异性降解dUTP,同时EDTA可以抑制dUTPase的活性;而Mg2+可以增强猪囊尾蚴dUTPase的活性。【结论】成功克隆表达了猪囊尾蚴dUTPase基因并鉴定了它的酶学活性,为进一步研究dUTPase在猪囊尾蚴中的生物学功能奠定了基础,同时也为抗猪囊尾蚴病的药物设计和开发提供了研究基础。

dUTP/UDG反应体系在荧光定量PCR中抗污染能力评价

目的 探讨dUTP/UDG反应体系在荧光定量PCR中抗PCR产物污染的能力。方法 用TaqMan荧光定量PCR检测方法进行定量检测。将一系列不同浓度的含dUTP的HBV DNA PCR扩增产物作为污染源 ,分别加至含dUTP/UDG的PCR反应体系和普通荧光定量PCR反应体系中 ,在荧光定量PCR仪上进行定量检测 ,从而得出含dUTP/UDG的PCR反应体系的抗污染能力。结果 1.最佳抗污染实验条件 :UDG酶含量 0 .0 5U ,消化时间 37℃ 5min ,灭活时间 92℃ 1min ;dUTP10 0 %代替dTTP ,四种底物浓度相等。 2 .含 0 .0 5U的UDG抗污染反应体系对每管浓度为 10 3 拷贝 /ml的污染物可完全消化 ,并随UDG含量的增高及消化时间的延长 ,抗污染能力增强。结论 dUTP/UDG反应体系的应用能有效防止PCR产物污染 ,但抗污染能力是有一定限度的 ,尚需加强实验室标准化管理 ,才能真正达到抗污染效果。

dUTP焦磷酸酶研究进展

dUTPase通过催化水解dUTP,降低尿嘧啶在DNA中的错误掺入,调节dUTP/dTTP的正常比例,保证了DNA复制的正确性和顺利进行。绝大多数dUTPase结构相似,活性中心由不同的亚基共同参与。dUTPase的活性已确定存在于真核及原核的多种组织中,其在细胞内的表达依赖细胞周期或细胞发育的调控。许多病毒也编码dUTPase,且与病毒的感染力有关。研究显示该酶的表达对由胸苷酸合成酶(TS)抑制剂产生的细胞毒性具有关键的拮抗作用,为dUTPase拮抗剂在癌症化疗和逆转录病毒治疗中的开发应用奠定了理论基础。

TdT介导dUTP缺口末端标记技术检测肝细胞癌凋亡

应用ＴｄＴ介导ｄＵＴＰ末端标记（ＴＵＮＥＬ）技术检测了３０例肝细胞凋亡病变，均见不同范围的阳性：单个癌细胞阳性１４例；点状阳性７例；小片状阳性６例；大片状阳性３例。偶见胞浆阳性。该技术快速、简便、灵敏、特异。

水稻总RNA反转录出Cy3-dUTP标记cDNA的研究

以提取的水稻叶总RNA为模板,Cy3-dUTP为标记,进行反转录,得出Cy3-dUTP标记的cDNA,对影响本实验结果的因素进行了探究。

化学致癌物暴露后哺乳动物细胞内及培养上清中核型dUTP焦磷酸酶的表达分析

目的:研究不同化学致癌物暴露后核型dUTP焦磷酸酶(DUT-N)在哺乳动物细胞内及培养上清中的表达情况。方法:分别用N-亚硝胺类烷化剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)和多环芳烃类致癌物苯并[a]芘在体内的终致癌物7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(BPDE)处理人羊膜上皮FL细胞、人肝癌HepG2细胞和人宫颈癌HeLa细胞。采用SDS-PAGE和免疫印迹法检测细胞培养上清中DUT-N蛋白的分泌及细胞内该蛋白的表达情况。结果:低浓度MNNG(0.25μmol/L)和BPDE(5nmol/L)暴露后都可引起DUT-N出现在FL细胞的培养上清中,而对HeLa细胞均无此影响;两者对HepG2细胞的影响不同,前者使DUT-N在细胞外出现,而后者却没有改变。同时,尽管MNNG与BPDE都可引起FL细胞胞外DUT-N的出现,但MNNG暴露后胞内DUT-N的表达dUTP下调,而BPDE暴露后却dUTP上调。结论:化学致癌物暴露后核型dUTP焦磷酸酶在细胞培养上清中出现的现象不具有化合物的特异性,但对特定细胞系(如FL细胞)可能存在化学致癌剂或DNA损伤剂的共性。同时,不同致癌物引起DUT-N出现的细胞反应可能是不同的。

白斑综合征病毒PCR检测中使用dUTP扩增的PCR产物极限长度

依据白斑综合征病毒的序列设计了7对PCR引物,扩增长度从600bp到1800bp。结果显示,使用dUTP代替dTTP,用普通Taq酶所能扩增的最大长度约为1400bp。Mg2+梯度研究发现,扩增片段长度越长,最适Mg2+浓度越低。使用具有3’-5’外切酶活性的Taq酶无法扩增出任何长度的片段。

dUTP/UNG体系研究进展及法医学应用展望

尿嘧啶-DNA糖基酶(UDG)是一种普遍存在的酶,在DNA损伤修复中起着关键作用。其亚家族I(UNG)专一性识别并催化去除DNA中的尿嘧啶。UNG结合dUTP组成的dUTP/UNG防污染体系,是消除PCR产物污染的重要方法。目前法医实验室DNA检验灵敏度不断提高,但是随之而来的污染问题引起研究者的日益关注,在法医学实验室应用dUTP/UNG防污染体系在防污染上具有独特优势,但是目前尚未有相关报道。文章综述了dUTP/UNG防污染体系的技术原理及研究进展,并展望了其在DNA实验室应用的优势和可行性。

地高辛配基-11dUTP的合成及应用

本文介绍了一种新型化合物——地高辛配基-11dUTP的化学合成及其应用。这种被地高辛半抗原所修饰的核苷酸能对基因探针进行非同位素标记,通过偶联指示酶的地高辛特异性抗体进行杂交探针的检测,以实现对靶DNA的测定,其检测灵敏度可达到甚至超过同位素标记探针,具有广阔的应用前景。

TS、TP和dUTPase在大肠癌原发灶和相应淋巴结转移灶中表达差异与5-Fu化疗敏感性关系的研究

目的 观察、探讨大肠癌、切缘正常组织及其相应转移淋巴结中氟尿嘧啶类药物代谢酶胸苷酸合成酶（TS）、胸苷磷酸化酶（TP）和dUTP焦磷酸酶（dUTPase）的表达情况;研究是否存在大肠癌原发灶与相应淋巴结转移灶中TS、TP和dUTPase表达水平的差异,以及与5-氟尿嘧啶（5-ru）化疗敏感性的关系;评估TS、TP和dUTPase作为5-Fu化疗敏感性判定指标的可行性.方法 应用免疫组化方法检测33例大肠癌、切缘正常组织及相应转移淋巴结中TS、TP和dUTPase的表达情况.结果 33例大肠癌淋巴结转移灶中TS和dUTPase的表达在表达水平、染色范围和染色深度三个方面均高于原发灶,差异有统计学意义（P＜0.05）;大肠癌原发灶和淋巴结转移灶中TP的表达均为高表达,无相关性;大肠癌原发灶与淋巴结转移灶的耐药性不尽一致.结论 大肠癌原发灶和淋巴结转移灶之间的TS和dUTPase表达水平比较差异有统计学意义,应根据转移灶本身的TS和dUTPase的表达水平选择化疗方案.

硫化叶菌病毒dUTPase基因的表达及酶学活性分析

对硫化叶菌病毒(Sulfolobus virus)STSV2脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)基因进行克隆表达,并分析其酶学特征.根据STSV2的dUTPase基因序列设计特异性引物,以病毒STSV2 DNA为模板进行PCR扩增,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,然后,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)进行dUTPase的IPTG诱导表达及纯化,通过SDS-PAGE检测其大小,并测定其酶学活性.结果表明,诱导表达的重组dUTPase蛋白分子量(Mr)约为38×103(含pET32a(+)自带的助溶标签),重组dUTPase在Mg2+存在的情况下能特异性催化dUTP生成dUMP和PPi,其反应最适温度为60℃,在pH值3-8之间有较高的活性,其在提高PCR扩增效率和特异性方面具有一定的作用.本研究通过克隆表达获得了硫化叶菌病毒(Sulfolobus virus)STSV2脱氧尿苷焦磷酸酶,其在基因扩增领域有一定的应用价值.

EB病毒相关疾病的病毒表达和人dUTP酶

脱氧尿嘧啶核苷三磷酸酶(dUTPase)催化从dUTP转化为dUMP以及焦磷酸盐的水解作用,因此阻止尿嘧啶整合到复制的DNA中。以前的一些病毒模型研究提示,静息状态下的细胞内病毒复制需要病毒dUTP酶,而在增生的细胞中,dUTP酶可能被一种突变的病毒蛋白代替。

玉米CMS-S小孢子败育过程中的细胞程序性死亡

以玉米(Zea maysL.)S型细胞质雄性不育系(CMS-S)的1对近等基因系S-Mo17Rf3Rf3和S-Mo17rf3rf3为材料,采用TdT介导的dUTP DNA末端标记(TUNEL)、细胞色素C免疫原位杂交和DNA寡聚核小体片段电泳等方法,分别在细胞学水平和DNA水平上研究了玉米CMS-S小孢子败育的细胞程序性死亡(PCD)过程。结果表明,在花粉母细胞减数分裂后的四分体解离时期,不育花药的绒粘层细胞较可育花药提前裂解;在不育系S-Mo17rf3rf3花药和花粉S-rf3中均明显出现PCD过程的DNA片段化以及线粒体细胞色素C外渗的现象,证明玉米CMS-S的花粉败育与花药绒粘层细胞的提前凋亡和小孢子细胞的程序性死亡有关。

激光辅助制动对精子核DNA的影响

目的:研究激光辅助制动精子是否引起精子核DNA损伤。方法:23例行体外受精(IVF)的男性精液标本,上游法处理后用0.45ms脉冲激光照射精子尾部制动精子。采用末端转移酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL)和单细胞凝胶电泳法(SCGE)两种方法分别检测激光辅助制动处理前后阳性精子百分率。结果:TUNEL法检测激光辅助制动处理前后阳性精子的百分率分别为(1.32±0.61)%、(1.41±0.51)%,差异无显著性(P>0.05);SCGE法检测处理前后阳性精子百分率分别为(1.59±0.70)%、(1.83±0.68)%,差异亦无显著性(P>0.05)。结论:激光照射精子尾部辅助制动精子对精子核DNA无明显损伤。

骨髓增生异常综合征骨髓细胞凋亡和TNF-α关系的研究

目的:探讨骨髓增生异常综合征(MDS)骨髓细胞凋亡特征以及与肿瘤坏死因子α(TNF-α)的关系。方法:分别采用形态学和dUTP末端缺口标记(TUNEL)方法检测骨髓细胞凋亡;采用ELISA方法检测骨髓单个核细胞培养后上清液中TNF-α的浓度,并与缺铁性贫血(IDA)患者进行比较。结果:形态学方法检测骨髓单个核细胞培养后细胞凋亡指数,MDS明显高于IDA(P<0.01),MDS各分型(RA/RAS、RAEB/RAEB-t)之间细胞凋亡指数差异无显著性意义(P>0.05)。同一个体TUNEL法测得的骨髓细胞凋亡指数均高于形态学观测的结果。TUNEL检测MDS细胞调亡指数RA/RAS>RAEB/RAEB-t,但差异无显著性意义(P>0.05)。MDS骨髓单个核细胞上清中TNF-α浓度高于IDA组,差异有显著性意义(P<0.05);MDS各分型之间RA/RAS显著高于RAEB/RAEB-t(P<0.05)。结论:MDS骨髓细胞确实凋亡过度,早期MDS重于晚期MDS,并与TNF-α呈线性关系;采用TUNEL法检测凋亡细胞较形态学方法敏感。

骨髓间充质干细胞移植可促进移植胰岛周围新生血管形成

目的探讨胰岛移植联合骨髓间充质干细胞(MSC)移植能否促进移植胰岛周围新生血管形成。方法以非肥胖糖尿病(NOD)小鼠作为受体,将NOD小鼠随机分为4组,联合移植组(6只)、单独胰岛移植组(6只)、单独MSC移植组(6只)、假性移植组(3只)。观察各组NOD小鼠移植后血糖和存活率的变化;采用5-乙炔基-2’脱氧尿苷(Ed U)及d UTP缺口末端标记(TUNEL)方法,在胰岛移植后1、2、4周检测单独胰岛移植组和联合移植组移植胰岛的增殖与凋亡情况;采用光学显微镜(光镜)直接观察、组织化学及免疫组织化学的方法观察并定量分析,移植术后2、4、8周单独胰岛移植组和联合移植组移植胰岛的周围新生血管密度。结果 MSC联合移植与胰岛单独移植均能明显改善移植后小鼠的血糖水平,提高NOD小鼠的存活率。MSC联合移植可促进胰岛细胞再生,减少细胞凋亡。联合移植组移植胰岛周围血管密度明显大于单独胰岛移植组。结论 MSC可以促进移植胰岛周围新生血管生成,增加移植胰岛的血供,保护移植胰岛的功能与活性。

^(125)I放射性粒子组织间植入治疗人胰腺癌裸鼠移植瘤的有效性研究

目的探讨125I放射性粒子组织间植入治疗人胰腺癌裸鼠移植瘤的疗效及其作用机制。方法人胰腺癌SW1990细胞株接种于BABL/c裸鼠右下肢旁腹股沟区偏背侧皮下,成瘤后取瘤块接种,6周后成瘤8～10mm。共16只成瘤大小合适的裸鼠用于实验,分别植入125I粒子(8只)和空载粒子(8只)。粒子植入后,每4天测量肿瘤的长径和短径并称裸鼠体重,裸鼠处死后称量瘤体重。瘤体标本行组织病理学检查、末端脱氧核苷酸转移酶-生物素dUTP切口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞及免疫组化染色检测增殖细胞核抗原。结果 125I粒子治疗组肿瘤体积增长缓慢,而对照组肿瘤体积增长迅速。实验组和对照组瘤体重分别约(2.68±0.70)g和(4.68±1.45)g,两者的差异有统计学意义(P=0.021);抑瘤率约42.66%。粒子植入前、后实验组和对照组间裸鼠体重对比差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组肿瘤细胞坏死明显,而对照组肿瘤细胞无明显或仅有少许坏死。TUENL法检查发现实验组和对照组的凋亡指数分别为(23.2±1.9)%和(8.1±1.5)%,两者的差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组化染色发现:实验组及对照组增殖细胞核抗原(PCNA)阳性染色指数分别为(49.8±1.8)%和(82.2±2.4)%,两者的差异有统计学意义(P<0.01)。裸鼠心、肝、肺、肾及脾脏等组织无明显放射性炎症表现。结论 125I粒子组织间植入治疗人胰腺癌裸鼠移植瘤是有效的,其作用机制包括:直接杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡及降低细胞增殖,并且125I粒子植入瘤体内对周围脏器是安全的。