猪DAZL启动子克隆、转录表达及蛋白功能特性分析

【目的】研究猪类无精症缺失基因DAZL在版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)中的启动子特征、转录表达及蛋白功能。【方法】使用PCR技术克隆DAZL启动子序列,并分析其结构;使用RNA测序技术获得BMI睾丸组织中DAZL的表达量,并构建转录调控网络;分析DAZL的氨基酸同源性与蛋白功能特性,并构建互作蛋白网络。【结果】成功扩增了DAZL长度为2378 bp的启动子序列,含1个CpG岛、3个核心启动子以及Oct-1、Sp1、Pit-1a等10种转录因子结合位点;DAZL在BMI睾丸组织中有较高的正表达;ceRNA调控网络分析表明DAZL被sscmiR-199a-5p、ssc-miR-199b-5p、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-103、ssc-miR-24-3p和ssc-miR-107等6个miRNAs靶向调控;功能注释发现其主要在精子发生、生殖细胞发育、翻译调控中发挥重要功能。DAZL及其邻近基因分析发现其在各物种中高度保守,且具有较为保守的邻近基因;蛋白互作网络、GO和KEGG富集分析显示DAZL与PUM2、DAZAP2和SYCE1等多个蛋白互作,主要参与精子发生、卵子发生、有性生殖等重要生殖相关通路;转录组数据与蛋白编码基因之间的表达量相关性显示DAZL的表达量与SOHLH1显著相关。【结论】本研究从DNA、RNA和蛋白质角度全面分析了猪DAZL的启动子结构、转录表达和蛋白功能,结果为更进一步研究DAZL在精子发生中的作用奠定了基础。

DAZL基因多态性位点(A260G、A386G)与亚洲和高加索男性不育关系的meta分析

目的:评估DAZL基因多态性位点A260G和A386G与亚洲和高加索男性不育的关系。方法:检索中英文数据库中国知网、万方、Pubmed等,搜索有关DAZL基因A260G和A386G位点多态性与亚洲和高加索男性不育关系的病例对照研究,从建库时间截止至2022年10月,对纳入的文献采用State11.0软件进行meta分析。结果:共纳入18项病例对照研究,关于DAZL基因A260G位点多态性与亚洲和高加索男性不育的研究共13项,纳入病例组3031例,对照组2029例;关于DAZL基因A386G位点多态性与亚洲和高加索男性不育的研究共16项,纳入病例组4987例,对照组4201例;两个位点5个比较模型结果未发现显著意义的关联,根据人种和基因分型方法的不同进行亚组分析结果发现,DAZL基因A386G位点在PCR-SSCP组别G比A(OR=10.42,95%CI 3.73~29.10,Ph=0.811)、GA比AA(OR=10.69,95%CI 3.80~30.08,Ph=0.885)、GA+GG比AA(OR=10.90,95%CI 3.88~30.66,Ph=0.855)存在显著意义的关联。结论:DAZL基因A260G位点多态性与亚洲和高加索男性不育不存在相关性,根据基因分型方法进行亚组分析发现在PCR-SSCP组A386G位点多态性与亚洲和高加索男性不育存在相关性。

常染色体DAZL基因单核苷酸多态性与男性不育相关性研究

目的:探讨常染色体DAZL基因单核苷酸多态性(SNP)与男性不育的关系。方法:收集东北地区男性不育症患者(不育组,n=144)和健康并已育有一子女的男性(生育组,n=53)精液标本,不育组按照WHO(1999)少、弱和畸形精子分类标准分成少弱畸形精子症组(n=17)、少弱精子症组(n=33)、弱畸形精子症组(n=13)、弱精子症组(n=54)和非少弱畸形精子不育症组(n=27),应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)筛选SNP260多态性,应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)筛选SNP386多态性,并测序验证和进行统计学分析。结果:不育组及生育组中均检测到SNP260A→G多态性,统计学分析差异无显著性(P>0.05),但在少弱畸形精子症组SNP260AG基因型比例大于其他各组;各研究组均未发现SNP386多态性。结论:SNP260和SNP386多态性与中国东北地区男性不育无相关性。前者AG基因型与少弱畸形精子的关系尚需进一步证实;后者多态性可能仅分布在台湾的一些狭小地区,两者均不能作为东北地区男性不育基因诊断的分子标志。

DAZL基因多态性位点(A260G、A386G)与无精子症和少精子症的关联性Meta分析

目的：探讨DAZL基因多态性位点（A260G，A386G）与无精子症和少精子症导致男性不育的关联性。方法：计算机检索PubMed、Sciencedirect、Wileyonlinelibrary、中国知网、维普中文科技期刊数据库、万方数据库，查找并筛选出研究DAZL基因多态性位点A260G和A386G与男性不育关系的病例对照研究，同时查阅检索结果中所附相似文献及参考文献，检索时限均为各数据库建库至2013年11月30日。由2名评价员单独进行文献筛选及资料提取，采用StataSEl2．0软件进行Meta分析以及其他相关统计学分析。结果：共纳入文献13篇（A260G位点多态性10篇，A386G位点多态性11篇）；男性不育患者共2715例，其中少精子症或无精子症患者共2500例，健康对照1835例。Meta分析结果显示，DAZLA260G位点多态性在等位基因模型、显性基因模型、隐性基因模型、共显性基因模型、超显性基因模型差异无统计学意义（P〉0．05）。而DAZLA386G位点多态性的分析表明，亚洲人中DAZLA386G位点多态性与少精子症或无精子症在等位基因模型、显性基因模型、共显性基因模型（AA／AG）和超显性基因模型下整体效应差异有统计学意义：等位基因模型优势比（OR）=0．15，95％可信区间（CI）0．07～0．34，P〈0．05；显性基因模型OR=0．16，95％C10．07～0．35，P〈0．05；共显性基因模型（AA／AG）OR=0．15，95％C10．06～0．33，P〈0．05；超显性基因模型OR=0．15，95％C10．06—0．33，P〈0．05。地区亚组分析结果显示，中国A386G位点多态性与少精子症或无精子症患者在等位基因模型、显性基因模型和超显性基因模型下总效应差异有统计学意义：等位基因模型OR=0．11，95％C10．04～0．28，P〈0．05；显性基因模型OR=O．11，95％CIO．04～0．28，P〈0．05；共显性基因模型（AA／AG）OR=0．09，95％C10．03～0．26，P〈0．05；超显性基因模型OR=0．09，95％C10．03～0．26，P〈0．05。结论：DAZLA260G位点多态性与精子生成或精子数量下降无相关性，而DAZLA386G位点多态性与精子生成或精子数量下降有相关性，而在地区亚种分析和人种亚组分析中这种相关性只在中国存在，因此探求DAZLA260G和A386G基因多态性与无精子症或少精子症导致的男性不育之间的相关性需要更多高质量的研究。

Real-time PCR检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中Boule、Dazl基因mRNA表达

旨在探讨DAZ基因家族Dazl和Boule基因与犏牛雄性不育的关系。采用实时荧光定量PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中DAZ基因家族Boule和Dazl基因mRNA表达并进行分析。结果表明,Boule和Dazl熔解曲线扩增产物呈现单特异峰,具有较高的灵敏度和特异性;标准曲线显示Ct值与重组质粒浓度间线性关系良好,相关系数均大于0.999;mRNA表达分析显示,3种牛中Dazl基因在犏牛睾丸组织中表达量最低,其中黄牛与牦牛、黄牛与犏牛差异显著(P<0.05),犏牛与牦牛差异不显著(P>0.05);Boule基因在3种牛睾丸组织中的表达量显示,黄牛与牦牛差异不显著(P>0.05),黄牛、牦牛与犏牛差异显著(P<0.05)。结果提示,Dazl和Boule基因可作为研究犏牛雄性不育的候选基因。

山羊DAZL基因的克隆及在山羊骨髓间充质干细胞中的表达

本研究以山羊睾丸组织为材料,用RT-PCR法成功克隆了山羊DAZL基因的cDNA序列950 bp,测序和生物信息学分析表明,其含有885 bp的完整开放阅读框(ORF),编码295个氨基酸,与牛的氨基酸序列同源性为97.97%,编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复基序;将山羊DAZL基因亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了山羊DAZL基因真核表达载体pEGFP-DAZL,采用脂质体法将其瞬时转染至山羊骨髓间充质干细胞(BMSC)中,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在山羊BMSC内的表达和定位。

猪类无精症缺失基因DAZL的cDNA全长克隆、组织表达和亚细胞定位

旨在获得猪类无精症缺失基因DAZL cDNA全长序列,阐明该基因的序列、mRNA组织表达模式、蛋白质结构特征及亚细胞定位情况。本研究以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)10月龄成年公猪为研究对象,屠宰收集组织样,利用RACE和RT-PCR技术获得DAZL基因cDNA全长序列;使用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测其mRNA多组织表达谱;在线分析蛋白质的结构特点和保守结构域;用体外细胞转染技术鉴定其在ST猪睾丸细胞中的定位。结果表明,BMI DAZL cDNA全长2985 bp(KU705632),包含888 bp的CDS区,编码295个氨基酸(AOC89050);该基因位于猪13号染色体,含11个外显子。qPCR结果显示,DAZL mRNA在睾丸中特异高表达。生物信息学分析表明,猪DAZL蛋白含有哺乳动物RMP和DAZ同源区,无规则卷曲在二级结构中超过50%。进化分析表明,BMI DAZL氨基酸序列高度保守,与牛科的亲缘关系最为接近。pEGFP-C1-DAZL转染ST细胞后的荧光共定位结果显示,DAZL蛋白主要分布在细胞核中。本研究分别从DNA、mRNA和蛋白质层面阐明了BMI DAZL基因的序列特征、表达、蛋白质结构和定位,为进一步研究DAZL在BMI精子发生方面的功能奠定基础。

牦牛DAZL基因编码区的克隆和序列特征与进化分析

根据黄牛DAZL基因序列设计引物,通过PCR扩增和克隆测序获得牦牛睾丸组织DAZL基因编码区序列,利用生物信息学软件分析牦牛DAZL基因编码区序列结构以及与其他物种的系统发育关系。结果表明:牦牛DAZL基因cDNA序列长度为1 782 bp,编码区全长885 bp,编码295个氨基酸,与黄牛的氨基酸序列同源性为98.31%;牦牛DAZL蛋白含有DAZ基因家族所具有的典型的RNA结合域和DAZ重复基序。系统发育分析显示:牦牛与黄牛首先聚为一类,然后与哺乳纲的其他物种相聚,而与鱼纲、爬行纲动物的亲缘关系最远。

黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Dazl基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Dazl基因mRNA表达水平。利用GenBank中牛Dazl mRNA序列,在其保守区设计并合成特异性引物,以牛肌动蛋白基因(β-actin)为内参,建立实时荧光定量PCR方法。结果表明,在100～10-6 7个拷贝量重组质粒稀释范围内,Dazl和β-actin基因的Ct值与重组质粒的含量均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.999。熔解曲线产物为特异的单峰,具有较高的灵敏度和特异性。Dazl基因重组质粒最小检出含量达到10拷贝/μL,批内变异系数保持在1.351%以内,批间变异系数保持在3.217%以内,重复性较好。Dazl基因的mRNA表达量在犏牛睾丸组织中最低,这一分布可能与犏牛精子发生过程中减数分裂调控作用相关。

DAZL基因与男性不育关系的研究进展

DAZL基因为DAZ基因家族成员之一,在人类精子发生的过程中,DAZL基因发挥着至关重要的调控作用。基因DAZL通过其表观遗传学修饰作用,主要是DAZ的甲基化,调控基因启动子来实现DAZL基因在生殖细胞中的表达。DAZL基因多态性位点分析(SNP)与男性不育依旧是一个值得探讨的研究方向,目前认为与地域和种族有关。本文通过总结近来的相关研究资料,阐述精子发生过程中的DAZL基因甲基化状态的改变以及DAZL的SNPs与男性不育之间的联系,为男性不育的治疗提供新的理论基础和临床思路。

利用液相芯片技术研究DAZL基因单核苷酸多态性与男性不育关系

目的建立液相芯片检测DAZL基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的方法,并探讨该基因SNP与男性不育的相关性。方法实验分为由无精症和严重少精症组成的病例组与健康自愿者组成的对照组,基于Luminex技术平台,应用等位基因特异性延伸反应(allele specific pri mer extension,ASPE),研究DAZL基因SNP260A→G和SNP386A→G的突变情况。结果196例病例中SNP260A→G和SNP386A→G突变分别为6例(3.06%)和4例(2.04%),40例对照组中只有1例(2.5%)SNP260A→G突变,没有发现SNP386A→G突变。所有突变均为突变纯合体,且没有发现同时存在两个突变的标本。两个位点的突变频率在病例组和对照组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论成功建立并应用液相芯片检测单核苷酸多态性的方法;DAZL基因SNP260A→G和SNP386A→G突变与成都地区男性不育没有明显相关性。

DAZL基因单核苷酸多态性与弱畸精子症的相关性研究

目的:探讨DAZL基因(deleted in azoospermia like)单核苷酸多态性(SNP)与弱精子症伴畸形精子症男性不育的关系。方法:收集弱畸精子症不育患者(病例组,n=173)和精液正常男性(对照组,n=175)精液样本,进行精液常规及精子形态学分析并提取精子基因组DNA,应用Sequenom MassARRAY SNP分型技术对DAZL基因A260G和A386G多态性位点进行基因分型,比较病例组与对照组基因型的分布差异。结果:在病例组与对照组中,DAZL基因A260G、A386G这两个位点均表现为野生基因型,无突变基因型。结论:DAZL基因A260G和A386G两个多态性位点与汉族男性精子活力低下及精子形态异常所致不育可能不存在相关,不足以视为男性不育的易感基因。

浙江地区无精子症和少弱精子症患者DAZL基因A260G和A386G单核苷酸多态性分析

目的：探讨浙江地区人群中DAZL基因A260G和A386G单核苷酸多态性（SNP）与无精子症和少弱精子症的关系。方法：收集浙江地区无精子症和少弱精子症患者317例和正常生育男性246例外周血标本,利用SNa Pshot SNP分型技术对样本DAZL基因Q260G和A386G多态性位点进行分型。结果：DAZL基因A260G在浙江地区汉族人群中具有多态性,其基因频率与基因型频率分布在病例组和对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡。AA、AG和GG的基因型频率在对照组中分别为92.3%、7.3%和0.4%,而病例组中分别为94.3%、5.7%和0%,统计学分析无显著性差异（P=0.430,OR=0.780,95%CI=0.413～1.46）。A386G突变只在正常对照组中出现1例杂合子AG,两组中都没有发现纯合子GG突变,两组之间亦无显著性差异（P=0.259,OR=0.698,59%CI：0.374～1.306）。结论：DAZL基因Q260G和A386G多态性与中国浙江地区无精子症和少弱精子症无相关性,两者都不能作为无精子症和少弱精子症遗传诊断的分子标志。

鸡Dazl基因的克隆及其亚细胞定位研究

为克隆鸡Daz(lDeleted in azoospermia-like,Dazl)基因CDS序列,通过构建eGFP标记的DAZL真核表达载体,实现该基因产物的亚细胞定位以探究其生物信息学功能。提取1日龄鸡睾丸总RNA,通过巢式PCR方法扩增出Dazl基因的CDS,构建真核表达载体pEGFP-C1-DAZL。采用LipofectaminTMLTX介导重组表达载体pEGFP-C1-DAZL转染CEF细胞,48h后于荧光倒置显微镜下观察其表达定位,同时利用RT-PCR和Western-blot进一步鉴定eGFP-Dazl和蛋白水平的表达情况。结果表明:克隆出Dazl基因的完整CDS,长度870bp,共编码289个氨基酸,与公布的鸡Dazl基因(GenBank登陆号:NM_204218)CDS区同源性达99%,编码氨基酸完全一致。酶切鉴定和序列分析均表明真核表达载体pEGFP-C1-DAZL构建成功。转染48h后,RT-PCR和Western-blot分别检测到949bp特异条带和59.7ku的融合蛋白。荧光显微镜观察显示,融合蛋白(eGFP-Dazl)主要分布于细胞核。

鸡Dazl基因启动子活性检测及其诱导剂的初步筛选

论文旨在确定Dazl基因核心启动子活性调控区,并比较不同诱导剂的诱导效率,筛选出最佳基因诱导剂。用PCR技术扩增不同长度的Dazl基因启动子,插入到pEGFP-N1和/或pGL3-basic载体中,构建重组载体;再将这些重组载体分别转染DF-1细胞系和GC-1细胞系,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定Dazl基因启动子核心活性区域;添加单因素或多因素诱导因子,比较不同诱导剂以及诱导剂组合对鸡Dazl基因启动子活性的影响大小。如皋黄鸡Dazl基因的-932bp^-186bp区域在DF-1和GC-1两种细胞中,都有不同程度的启动活性,而-186bp^-39bp启动子活性几乎完全丧失;诱导剂筛选结果表明,FSH+E2组和Am80组、E2组能够显著提高Dazl基因启动子的活性,RA组、ATRA组、FSH组和睾酮组都不同程度地提高了启动子的活性,而睾丸提取液和BMP4对启动子活性没有显著影响。通过体外诱导实验筛选出如皋黄鸡Dazl基因最适诱导剂,为鸡ESCs体外向雄性生殖细胞分化的细胞诱导剂进一步筛选奠定了基础。

小鼠DAZL基因启动子核心区域分析及甲基化对其启动活性的影响

旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制。采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到p EGFP-N1和p GL3-Basic载体,构建重组载体。将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化。双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370^-36 bp,在-370^-166 bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性与对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著。本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考。

牛DAZL基因序列分析、克隆及表达载体构建

利用生物信息学方法对牛DAZL基因的一级结构和同源性进行分析,并根据牛DAZL基因序列设计引物来克隆该基因,通过酶切、连接、转化构建该基因的表达载体,成功克隆到了DAZL基因。生物信息学分析结果显示,哺乳动物的DAZL基因同源性很高。此外,构建了牛DAZL基因的带绿色荧光蛋白的真核表达质粒p EGFP-N3-DAZL。

Dazl基因mRNA表达水平与犏牛雄性不育关系的研究

本文旨在探讨Dazl基因与犏牛雄性不育的关系。采用实时荧光定量PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Dazl基因mRNA表达并进行分析。结果表明:三种牛中Dazl基因在睾丸组织中特异表达,且犏牛睾丸组织中表达量最低,其中黄牛与牦牛、黄牛与犏牛差异显著(P<0.05),犏牛与牦牛差异不显著(P>0.05)。结果提示,Dazl基因在三种牛睾丸组织特异表达,说明Dazl基因在细胞周期运行中发挥作用,Dazl基因在犏牛睾丸组织中低表达与犏牛雄性不育相关。

水貂DAZL基因的DNA池测序分析

选取短毛黑、银兰、红眼白水貂构建品种DNA池。扩增DAZL基因部分序列,对扩增产物测序。从测序结果分析可以看出,不同品种水貂间的DAZL基因部分序列完全一致;同源性表明,水貂与雪貂同源性很高(94.2%),与猪、犀牛、骆驼、江豚同源性较高(80.8%～81.8%),与牛的同源性较低(77.4%)。系统进化树显示,水貂与雪貂属同一分支。

DAZL基因单核苷酸多态性与男性不育相关性研究

目的探讨常染色体DAZL基因单核苷酸多态性与男性不育的关系。方法采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测71例男性不育患者和200例正常对照者DAZL基因单核苷酸多态位点Rs2303591A>G的基因型,计算基因型频率和等位基因频率,对比分析两组基因频率和基因型频率分布。结果Rs2303591A>G位点在中国汉族人群中具有多态性,其基因频率与基因型频率分布在病例组和对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡,基因型AA、GA和GG的频率在病例组分别为0.155、0.563和0.282,在对照组中分别为0.285、0.550和0.165,该位点的基因型频率在病例组和对照组间的差异均无统计学意义(P>0.05),而基因频率差异有统计学意义(P<0.05),提示该多态位点与中国汉族人群男性不育无显著相关性。结论DAZL基因Rs2303591A>G与中国汉族人群男性不育易感性没有显著相关性。