简并PCR及其应用

简并PCR技术是根据同源蛋白的氨基酸序列扩增到同源基因的核苷酸序列,具有独特的优点。成功进行简并PCR的关键是设计好两组引物库和对反应条件进行优化。由于简并PCR自身的特点,在新基因的克隆、基因表达检测、病毒检测和基因组研究中有其广泛而独特的应用。

斑茅NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已知NBS-LRR抗病基因[含有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)的胞内受体蛋白基因]NBS结构域蛋白质的保守序列,设计简并引物,对斑茅基因组进行体外扩增,获得了对应区段的DNA片段,回收、克隆这些特异片段,测序分析,共获得8个片段序列。序列分析发现其中7个编号分别为RGA-Q1、RGA-Q2、RGA-Q3、RGA-Q4、RGA-Q5、RGA-Q6和RGA-Q7的片段推导的氨基酸序列均具有典型的NBS结构域,即P-loop(GGVGKTT)、Kinase-2a(VLDDVW)、Kinase-3a(GSR/KILVTTR)及疏水结构域HD(hydrophobic domain)。它们在NCBI上的登录号为EU685828、EU685829、EU685830、EU685831、EU685832、EU685833和EU685834。这些抗病基因同源片段(RGA)与已经克隆的N、L6、RPS2和Mi等11个抗病基因在氨基酸水平上的同源性为2.3%～39.8%,可进一步用作斑茅抗病候选基因的分子筛选及遗传图谱的构建。

STR滑脱模型的构建及其影响因素

目的探索建立体外STR滑脱模型,研究STR滑脱产生的影响因素,探讨STR的发生机制。方法首先通过全基因组扩增技术—简并寡核苷酸引物PCR(Degenerateoligonucleotide-primedPCR,DOP)对模板DNA样本进行扩增放大,然后以其产物作为后续STR分析的模板,对以上实验过程中的一系列实验条件进行控制,观察滑脱现象的产生情况。结果初步建立了STR的滑脱模型,观察到了STR滑脱现象的发生。结论STR的发生是一系列综合因素作用的结果,DNA模板用量、MgCl2的浓度、DNA聚合酶的性质、样本以及STR的基序组成等因素均可能参与了这一过程。

NR2A反义寡核苷酸对短暂性脑缺血/再灌注大鼠海马神经元损伤的保护作用

目的探讨NMDA受体亚单位2A(NR2A)反义寡核苷酸在短暂性脑缺血/再灌注大鼠海马神经元损伤中的保护作用,为研制和开发针对NR2A的特异性新药提供理论基础和形态学依据。方法健康♂SD大鼠随机分为正常对照组、假手术对照组和缺血/再灌注组。经生理盐水、错义寡核苷酸和反义寡核苷酸预处理后,以四血管阻断法建立短暂性全脑缺血(15min)/再灌注(1、2、3和5d)动物模型。在确定的时间点进行灌注固定、取材、石蜡包埋和组织切片(片厚8μm),然后行TUNEL反应、焦油紫染色、原位杂交染色以及免疫组织化学染色。结果短暂性脑缺血/再灌注(I/R)3d,大鼠海马CA1区出现大量的凋亡阳性细胞;I/R5d大鼠海马CA1区细胞严重受损,与对照组相比二组差异具有显著性(P<0.05)。经NR2A反义寡核苷酸预处理后,I/R3d和I/R5d海马CA1区的细胞凋亡和细胞损伤明显减轻,与对照组相比二组差异具有显著性(P<0.05)。NR2A反义寡核苷酸能抑制I/R1d NR2A mRNA表达和I/R2d蛋白质表达,与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)。结论短暂性全脑缺血后,NR2A反义寡核苷酸能明显地减轻缺血诱导的大鼠海马CA1区细胞凋亡和细胞损伤,且这种作用与NR2A反义寡核苷酸特异性抑制NR2A及其mRNA的表达密切相关。

利用差异显示技术克隆小麦抗白粉病相关基因的研究

对小麦—簇毛麦抗病易位系进行差异显示分析,以期获得小麦抗白粉病基因的分子克隆。根据已克隆植物抗病基因的保守域,设计了简并引物,与锚定引物组合,对抗病诱导的小麦抗白粉病易位系进行了差异显示分析,共获得10个差异片段,其中两个片段R3-1和8C1.3-6Northern杂交为阳性。将这两个片段克隆后进行了测序,序列分析结果为两个新序列,GenBank登录号分别为AF498271和AF498272。R3-1没有发现同源性较高的植物基因序列,发现8C1.3-6与Sphenostylisstenocarpa 类几丁质酶基因有同源性。

用荧光原位杂交技术显示染色体易位(英文)

目的 :应用荧光原位杂交技术 (fluorescence in situ hybridization,FISH)对 G显带提示有染色体易位的病例进行分析 ,阐明易位本质。 方法 :以定位于待研究染色体区段的酵母人工染色体 (yeast artificialchrom osom e,YAC)作为 DNA来源 ,采用 DOP- PCR(degenerate oligonucleotide- primed,PCR)方法制备荧光标记的位点特异性探针 ,进行染色体原位杂交。结果 :两例经 G显带未能明确显示的染色体结构异常 ,经 FISH证实 ,一例为发生于 11号染色体与 13号染色体之间的平衡易位 ;另一例为发生于 6号染色体与 X染色体之间的不平衡易位。结论 :FISH技术以其高度的灵敏性及特异性 ,成为常规染色体显带技术的一个重要补充 ,特别适用于对微小染色体结构重排以及染色体片段起源的阐明。

硝普钠(SNP)和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的白桦Ty1-copia类逆转座子的克隆及分析

利用Tvl—copia类逆转座子逆转录酶（RT）的保守区域设计引物，优化了扩增条件后利用RT—PCR从白桦愈伤组织中得到了1条逆转录酶序列。利用硝普钠（SNP）和茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后分别扩增克隆了11条和9条逆转录酶序列。这2l条逆转录酶序列（命名Bprtl-21）变化范围为205—290bp，一致性为71．93％，异质性为1．1％。50．9％，翻译成氨基酸的异质性为0～57．1％。经SNP和MeJA处理的样品中，获得的逆转录酶序列基本是分别聚类．初步证明不同的Tvl-copia类逆转座子能够分别响应不同的信号而被转录激活。分析所获得的21逆转录酶序列和苹果中19务逆转录转座子序列（DQ410748-DQ410766）进化关系发现．逆转录酶基本各自聚类。但是Bprt9、Bprtll和OQ4m750进化关系比较接近，Bprt15、Bprt19、DQ410751和DQ410753聚为一类，证明逆转座子存在水平传递。

2种PCR技术扩增微分离的蚕豆染色体

用接头介导的PCR (polymerasechainreaction ,LA PCR)和简并寡核苷酸PCR(DOP PCR)2种技术对微分离的蚕豆 (viciafaba)大M染色体进行了扩增 ,并对扩增结果及 2种PCR技术的优缺点进行了比较 .结果表明 ,LA PCR的扩增产物大小为 0 .3～ 3kb ,而DOP PCR的扩增产物大小为0 .3～ 1.3kb .LA PCR的对照中未观察到扩增产物 ,而DOP PCR的对照中却明显观察到扩增产物 ,此扩增产物是由于引物之间相互退火而形成的二聚体或更高级的聚合体 .LA PCR的Southern杂交信号明显强于DOP PCR ,可见LA PCR的扩增效率明显高于DOP PCR .

单细胞退变寡核苷酸引物PCR-比较基因组杂交研究

目的 探索单细胞退变寡核甘酸引物PCR(DOP-PCR) -比较基因组杂交 (CGH)技术应用于单细胞全基因组分析及着床前胚胎遗传学研究的可能性。方法 建立单个淋巴细胞的DOP -PCR技术 ,分别以正常男性的组织DNA和单细胞DOP -PCR产物为参照 ,进行正常男、女性和X单体、X、13和21三体单细胞DOP-PCR产物的CGH。结果 X染色体在以组织DNA为参照的CGH中呈假性过度表达,13、21三体未能显示阳性结果。以单细胞DOP -PCR产物为参照的CGH不仅能正确反映X和Y拷贝数 ,而且能显示13和21三体相应染色体的过度表达。结论 单细胞DOP-PCR存在非随机的不均匀扩增 ,其对CGH的影响 ,能通过应用单细胞DOP -PCR产物为参照而得以纠正。单细胞DOP-PCR

共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应在呼吸道副黏病毒科病毒诊断中的应用

采用共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应(CODEHOP PCR)体系和商品化RV12试剂盒对急性呼吸道感染患儿下呼吸道标本中的副黏病毒科病毒进行检测,比较CODEHOP PCR与RV12试剂盒检测结果的符合率和敏感度,观察CODEHOP PCR在临床呼吸道标本中对副黏病毒诊断的应用价值,进一步探讨具备检测已知呼吸道病毒和未知新病毒特点的CODEHOP PCR在呼吸道疾病谱和未知潜在呼吸道病毒诊断中的推广价值。采集2011年上海市儿童医院因急性呼吸道感染住院的患儿下呼吸道标本572份,分别采用2种方法对副黏病毒进行检测。CODEHOP PCR检测出阳性标本113例,阳性率为19.76%;RV12试剂盒检测出阳性标本102例,阳性率17.83%;2种方法检测符合率为85.39%。以10倍倍比稀释呼吸道合胞病毒A(RSVA)感染的细胞收获液,检测结果显示,CODEHOP PCR和RV12试剂盒检测下限分别为10-8和10-6。CODEHOP PCR具备简便、易操作和测序精度高等特点,适合疾病预防系统和临床检验科使用。该方法与一些新兴的高通量快速分子诊断技术结合,可提高检测灵敏度,具有高通量、快速检测和筛查未知新病毒的优势,在呼吸道病原体检测领域值得进一步优化和推广。

尼罗罗非鱼X和Y染色体原位杂交探针的制备

通过染色体显微切割的方法 ,分别从尼罗罗非鱼XX和YY个体有丝分裂中期相染色体滴片上 ,割取第 1对染色体 ,随后经简并PCR扩增 ,分别用生物素和地高辛标记 ,得到X和Y染色体探针。将探针与尼罗罗非鱼XY个体的染色体进行荧光原位杂交 ,在第 1对染色体上得到很强的杂交信号。结果表明 ,染色体显微切割和简并PCR技术相结合 ,可以有效地制备鱼类DNA探针。

葎草单染色体的显微分离及DOP-PCR技术体系建立

葎草是具有XX/XY1Y2性染色体系统的雌雄异株植物,是研究植物性染色体演化的模式材料之一.利用染色体显微分离技术从葎草根尖有丝分裂中期分裂相中将单条染色体进行了显微分离及DOP-PCR(Degenerate oligonucleotide primer-PCR)扩增,并构建了单染色体DOP-PCR扩增产物的荧光探针,对葎草根尖有丝分裂中期分裂相染色体进行了荧光原位杂交,其结果表明荧光信号分布在所有的染色体上,表明所建立的技术体系能够成功分离葎草单染色体并进行DNA扩增.本研究结果为进一步进行葎草X,Y染色体的细胞及分子生物学研究提供了技术支持.

简并寡核苷酸引物PCR技术的建立及其检测灵敏度分析

目的建立基于简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primed-PCR,DOP-PCR)的全基因组检测体系,并对其可靠性、灵敏度进行研究。方法通过荧光标记STR复合扩增毛细管电泳检测系统,对DOP-PCR扩增产物进行检测,获得DOP-PCR检测体系的灵敏度、可靠性。结果成功建立了可靠的DOP-PCR检测体系,经过DOP-PCR预处理再进行STR分型检验,其检测灵敏度可达到5个细胞量(相当于30 pg)。结论本研究建立的DOP-PCR技术可靠且可提高法医学微量检材的检测灵敏度。

简并PCR在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR(CODEHOP-PCR)在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段,经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序,与Genbank提供的序列比较,确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明,所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上,其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定,与传统的病毒分离及血清中和试验相比,具有更快速、准确的优点。

简并寡核苷酸引物PCR扩增单细胞基因组的影响因素研究

[目的]研究影响简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)扩增单细胞全基因组的因素。[方法]以单个人外周血淋巴细胞为材料,进行DOP-PCR,研究新鲜细胞与冷藏细胞及采用新鲜和冻存的细胞裂解物为模板对扩增产物的均匀性及特异性的影响。[结果]以新鲜的淋巴细胞为模板与以冷藏的淋巴细胞为模板相比,扩增产物的均匀性相当,特异性上新鲜细胞较好。细胞裂解后立即进行扩增的效果在产物的均匀性及特异性方面均明显优于冻存的细胞裂解物。[结论]对单细胞应用DOP-PCR方法进行全基因组扩增时,应尽量选取新鲜细胞进行裂解,裂解后避免冻存以保证扩增的均匀性及特异性。

单细胞的DOP—PCR—CGH分析

为探索退变寡核甘酸引物多聚酶链反应(DOP-PCR)比较基因组杂交(CGH)单细胞基因组研究的可能性,用DOP-PCR扩增正常XX、XY,异常XO、XXY、13三体和21三体单个细胞基因组DNA,经萤光标记后,分别以正常男性基因组DNA和正常男性单个淋巴细胞DOP—PCR产物为参照,进行CGH分析。结果以基因组DNA为参照的CGH双色荧光强度比均数波动围大,约30％区域的标准差超过正常允许范围,X染色体呈假性过度表达,未能检出13,21三体。以单细胞DOP-PCR产物为参照的CGH强度比均数接近期望值1.0,仅6％的标准差超出正常波动范围,13和21三体的相应染色体大部分常染色质区过度表达。结论:单细胞DOP-PCR存在非随机的不均匀扩增,其对CGH的影响,能通过应用单细胞DOP-PCR产物为参照而得以纠正。单细胞DOP-PCR-CGH及其用于着床前胚胎及母体血胎儿单细胞全基因组研究具有可能性。

云南悬钩子蔷薇NBS-LRR类抗病基因同源克隆与分析

为研究云南野生蔷薇属中的NBS类抗病基因,根据已知抗病基因NBS-LRR序列中的保守区域设计简并引物,利用RT-PCR技术从云南悬钩子蔷薇中进行体外扩增,获得了对应区域的cDNA片段,回收、克隆这些特异片段,测序分析,共得到4个含有NBS-LRR保守结构域的抗病基因同源序列(RGAs),分别命名为AC9、AC39、AC50和AC68。它们与已报道的11个NBS类抗病基因相应区段的氨基酸序列相似性为5.4%～79.2%,其中这4个RGAs片段与Mi、RPS2、Pib和RPM1基因聚为一类。表明这4条RGAs序列可进一步用作悬钩子蔷薇抗病候选基因的分子筛选及遗传图谱的构建。

两种全基因组扩增技术对单根毛发DNA检验效能的研究

目的研究简并寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide-primed PCR,DOP-PCR)和扩增前引物延伸PCR(primer extension pre-amplification PCR,PEP-PCR)对单根毛发检验的法医学价值。方法以三种方法对单根毛发样本进行STR分型,第一种方法直接对提取DNA用Profiler Plus试剂盒进行STR分型,第二种和第三种方法是先对提取的DNA样本分别进行DOP-PCR和PEP-PCR扩增处理,然后对其产物用Profiler Plus试剂盒进行STR分型,对两种方法的效能进行比较评价。结果 DOP-PCR和PEP-PCR技术增加了单根毛发STR分型的准确率和信息量。结论 DOP-PCR和PEP-PCR技术对单根自然脱落毛发的检验具有实用价值。

引物延伸预扩增结合简并引物PCR在单细胞比较基因组杂交分析染色体异常中的应用

目的 建立一种可信的单细胞全基因组扩增（whole genome amplification.WGA）技术,结合比较基因组杂交（comparative genomic hybridization,CGH）分析单细胞的染色体拷贝数变化,探讨其在胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis,PGD）中的应用前景.方法 采用引物延伸预扩增结合简并核苷酸引物PCR（primer extension preamplification with degenerate oligonucleotide primed-PCR,PEP-DOP-PCR）的方法,扩增12个已知核型的单细胞标本（包括5个绒毛标本、4个干细胞标本和3个淋巴细胞标本）和4个经PGD检测发现染色体异常的单卵裂球标本,将扩增产物标记红色荧光染料后,与标记绿色荧光染料的正常DNA等量混匀,与正常中期分裂相进行比较基因组杂交分析.同时,应用单纯的简并寡核苷酸引物-PCR（DOP-PCR）扩增10个单细胞DNA,标记后进行CGH分析.比较两种单细胞全基因组扩增方法的扩增效率及随后用于CGH分析染色体拷贝数时的准确性.结果 所有的单细胞采用PEP-DOP-PCR扩增时,均能获得稳定均匀的PCR产物,片段大小范围在100～1000 bp之间,集中分布于400 bp左右的区域,CGH分析结果显示染色体拷贝数变化与其它技术检测的结果一致.而10个单纯的DOP-PCR扩增只有6个标本成功,扩增产物进行CGH分析时,杂交信号不均匀,有2个显示与其它技术分析的结果不一致.结论 PEP-DOP-PCR技术能有效地扩增单细胞的全基因组DNA,其扩增产物可应用CGH技术成功检测单个细胞的染色体拷贝数变化,而单纯的DOP-PCR技术易于出现扩增失败、扩增产物杂交后信号不均一的缺点.PEP-DOP-PCR全基因组扩增结合CGH技术在胚胎植入前遗传学诊断中有良好的应用前景.

实验模型下两种全基因组扩增技术对指纹DNA检验的效能

目的对简并寡核苷酸引物PCR(Begenerate oligonucleotide-primed PCR,DOP-PCR)和扩增前引物延伸PCR(Primer extension pre-amplification PCR,PEP-PCR)用于指纹检材DNA检验的价值进行研究。方法建立2种指纹检材DNA模型,分别用普通PCR、DOP技术和PEP技术三种方法对指纹DNA样本进行STR分型,对三种方法的效能进行比较评价。结果实验模型1条件下,三种方法均不能获得满意分型结果;模型2条件下,DOP和PEP两种方法可以增加STR分型的成功率和信息量。结论 DOP和PEP技术必须结合高效的DNA提取技术才能最大程度发挥其检验效能。