食品中五种致病性弧菌MPCR-DHPLc检测方法的建立

采用试剂盒法提取5种致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组DNA。分别合成5对特异性引物,对PCR反应体系进行优化后,建立了5种致病性弧菌间的MPCR-DHPLC检测方法。二重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100CFU/ml。建立的MPCR-DHPLC方法在食品中弧菌的检测上具有很好的应用价值。

DHPLC对猪肌肉组织差异表达EST的鉴定

采用DHPLC系统和LabWork4 0图像分析软件 ,对大白猪和广东地方品种蓝塘猪眼肌组织差异显示EST进行鉴定 ,两种方法均证实了差异显示条带的真实性。结果表明 :用DHPLC系统能够准确而简捷的检测不同组织中mRNA表达的差异 ,是 1种鉴定基因表达差异的有效方法 ,在研究基因表达 。

应用MPCR-DHPLC技术检测转基因大豆及其食品

利用多重PCR结合DHPLC技术,建立了高通量快速筛选检测转基因大豆及其食品的方法,确立了转基因大豆品系鉴定方法。该筛选方法的检测灵敏度为0.078 ng.μL-1,质粒检测灵敏度为1×103拷贝.μL-1。利用该方法对转基因大豆GT-40-3-2、Mon89788、A5704-12和大豆食品曲奇饼干、含大豆的调味粉、干豆腐及非转基因黑大豆进行验证,效果良好。所建立的PCR-DHPLC检测方法能同时快速准确的检测大豆及加工食品中转基因成分。

DHPLC-mtDNA控制区多态性分析系统的建立

目的基于变性高效液相色谱技术,建立一种不需测序和杂交的新的mtDNA控制区多态性分析系统。方法mtDNA控制区序列(包括HVⅠ,HVⅡ和HVⅢ)被分为4个扩增片段,采用配对分析突变检测模式进行DHPLC分析。对DHPLC检测条件(包括柱温和洗脱梯度等)进行优化。对100个不同类型差异序列的组合配对以检验该方法的检测效力。结果10组序列相同的样本配对DHPLC图谱均只显示1个样品峰。对序列相差1个碱基～7个碱基、插入(/缺失)1个碱基、插入(/缺失)2个碱基等类型的90个扩增片段组合,用DHPLC进行分析,均得到≥2个样本峰的DHPLC图谱,序列差异检出率达100%。该技术可检测的异质性DNA成分的最小百分含量为10%。结论DHPLC-mtDNA控制区多态性分析系统快速、经济和实用,在检测mtDNA异质性方面较直接测序更灵敏。

多重PCR-DHPLC快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌

应用多重PCR(motiplex PCR)结合变性高效液相色谱技术(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)建立了快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的方法。以基因wzx O111、rfb EO157为靶基因,建立多重PCR-DHPLC方法,进行特异性和灵敏度测试,同时进行RT-PCR检测比较灵敏度。该方法具有良好特异性,可以一次PCR扩增同时检测O111、O157;灵敏度达到25 CFU/m L。129份牛肉样品中检出1例O111,3例O157阳性;74份鸡肉样品中检测出O111、O157阳性各1例,67份蔬菜样品中未检测到O111、O157。本文建立O111、O157多重PCR-DHPLC检测方法,操作简便,特异性强,适用于产志贺毒素大肠杆菌筛选检测。

荷斯坦奶牛凝血因子Ⅺ缺乏症的PCR-DHPLC检测方法的建立

为了有效地检测荷斯坦奶牛凝血因子Ⅺ缺乏症,试验以制备的纯合突变、野生型基因为模板,优化PCR反应体系,制备异源双链体系,建立多聚酶链反应-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)的检测方法,确定最佳的检测条件,并用建立的方法对120个样本进行检测,再与传统的方法进行比较和验证。结果表明:所建立的PCR-DHPLC方法可以用于检测牛凝血因子Ⅺ缺乏症,与传统方法的检测结果一致。说明PCR-DHPLC方法是一种高通量、准确性高、特异性好的检测方法。

应用DHPLC技术分析浙江沿海地区ESBLs基因类型的研究

目的应用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术检测超广谱β-内酰胺酶(extend spectrumβ-lactamases,ESBLs)基因型,了解浙江沿海地区ESBLs基因型分布情况。方法收集171株多重耐药肠杆菌及标准菌株采用多重PCR进行头孢克肟-M型(CTX-M)扩增,扩增产物经DHPLC分析,确定临床菌株基因分型。结果171株多重耐药肠杆菌经表型试验有142株临床菌株ESBLs表型阳性,经多重PCR扩增109株携带CTX-M基因,其中52株为CTX-M-1产物,57株为CTX-M-9产物,检出率达76.8%(109/142)。其中大肠埃希菌携带CTX-M基因比例最高(92.3%),其次是肺炎克雷伯菌(72.3%)和阴沟肠杆菌(60.0%)。109株临床菌株PCR产物经DHPLC分析检测出4种CTX-M基因型,33株携带CTX-M-3、19株携带CTX-M-15、5株携带CTX-M-9、52株携带CTX-M-14。结论 CTX-M型ESBLs菌株检测出4种基因型,CTX-M-3、CTX-M-15、CTX-M-9和CTX-M-14,其中CTX-M-14型是CTX-M型ESBLs主要型别。浙江沿海地区携带CTX-M型ESBLs的细菌以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌为多见。

变性高效液相色谱检测食品中致泻性大肠杆菌

【目的】应用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中致泻性大肠杆菌的快速检测方法。【方法】分别根据4种致泻性大肠杆菌的特异性毒力因子基因序列设计引物,PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。以肠产毒性大肠杆菌等32株试验菌株做特异性检测;4种致泻性大肠杆菌标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。【结果】试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:肠产毒性大肠杆菌27CFU/mL、肠致病性大肠杆菌33CFU/mL、肠出血性大肠杆菌25CFU/mL、肠侵袭性大肠杆菌42CFU/mL。【结论】该方法可以快速、准确地检测食品中的致泻性大肠杆菌,是食品中病原菌检测的新技术和新方法。

13例肝豆状核变性家系致病基因突变的检测和分析

为了研究Wilson病(wilson disease,WD)基因突变的类型和发生情况,探讨WD疾病的病因、临床特点,通过采用变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)方法结合DNA测序方法对13例无亲缘关系的患者及33位亲属进行ATP7B基因所有外显子及5′端非转录区突变检测.33例DNA标本确认11种基因突变,其中包括9种错义突变(p.R778L、p.R919G、p.T1178A、p.T977M、p.K1010Q、p.C490TERM、p.A874P、p.G943S、p.G943D),1种缺失突变(2790delCAT),1种剪切位点改变(c.1708-1G>C(intron 4+1 G>C)).在13个家系中,发现4例R778L突变,2例2790delCAT,均为杂合型突变,涉及17个等位基因,本组检出率为70.8%(17/24).DHPLC-测序法是WD疾病基因突变筛查较为快捷、全面而且敏感的方法.WD基因突变存在热点区分别为3、8、12号外显子.2790delCAT、p.K1010Q、c.1708-1G>C(intron 4+1 G>C)是ATP7B基因新突变类型,p.S406A、p.V456L、p.V1140A、p.R952K是中国人比较常见的多态类型.

胃癌细胞色素氧化酶CYP3A4基因多态性与含紫杉醇方案化疗敏感性的研究

目的探讨胃癌细胞色素氧化酶CYP3A4基因多态性与含紫杉醇方案化疗敏感性的关系。方法采用变性高效液相色谱技术（DHPLC）和基因测序技术检测53例晚期胃癌患者外周血中CYP3A4基因的突变情况，观察并评价含紫杉醇化疗方案的疗效与CYP3A4基因多态性的关系。结果DHPLC检测显示，53例胃癌患者中CYP3A4基因单峰者（野生型）32例，双峰者（突变型）21例；测序结果显示，CYP3A4基因第10号外显子第27位C缺失突变。野生型组有效率（RR）为40．6％，疾病控制率（DCR）为84．4％；突变型组RR为33．3％，DCR为85．7％，两组RR和DCR的差异均无统计学意义（P〉0．05）。53例胃癌患者的中位无进展生存时间（PFS）为6．5个月（95％CI：3．576～9．424个月），中位总生存时间（OS）为11．0个月（95％CI：6．955～15．045个月）。CYP3A4野生型与突变型患者中位PFS（7．0个月掷．7．0个月）和OS（10．0个月vs．14．0个月）的差异均无统计学意义（P〉O．05）。使用含铂方案患者CYP3A4基因野生型和突变型中位PFS的差异无统计学意义（P〉0．05），使用非含铂方案中位PFS的差异有统计学意义（p=0．024），含铂与非含铂方案中位0s的差异均无统计学意义（P〉0．05）。采用3药联合与两药联合方案患者的中位PFS和0s均与CYP3A4基因多态性无关。野生型与突变型患者不良反应均较轻，以1～2级为主，常见不良反应包括食欲减退、恶心呕吐和白细胞减少。结论CYP3A4基因第10号外显子第27位C缺失突变，CYP3A4基因突变型晚期胃癌患者使用含紫杉醇方案有延长0s的趋势。

变性高效液相色谱技术在大豆品种鉴定中的应用

单核苷酸多态性(SNPs)和插入-删除标记(In Del)在基因组中广泛分布,日益成为主要作物的重要遗传标记。利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测大豆品种的SNP和In Del的多态性,可为大豆种质的品种鉴定提供一种新型的快速检测方法。基于公共数据库中的大豆基因信息,筛选了3条DNA序列作为目标分析片段,以大豆种质粤夏119作为参比基因型,利用DHPLC技术平台对10份大豆品种进行了鉴定。结果表明:混合参比DNA后的大豆样本产生DHPLC谱图均具有多态性,谱型与测序基因型一一对应。综合3条目标片段的DHPLC特征谱图可以区分所有大豆品种。试验结果验证了DHPLC应用于大豆品种鉴定的可行性和可靠性。由于DHPLC分辨率高、快速、操作简单、安全等优点,在大豆的品种鉴定中具有良好的应用前景。

变性高效液相色谱法检测鸡HSP70基因单核苷酸多态性

选取我国20个地方鸡种共591个个体作为实验材料,采用变性高效液相色谱(DHPLC)技术,在鸡HSP70基因的全序列内进行未知SNPs的筛选,对有变异的色谱峰型分别选取2个个体测序,再将同一对引物的所有测序样本的测序结果进行序列的同源性比较,从而识别和确认鸡HSP70基因的未知SNPs。结果分别在4对引物扩增的PCR产物中检出并确认了10个SNPs:A258G、C276G、C507T、C1040A、G1044A、C1431A、T1476C、G1500A、A1529G、C1722T。

变性高效液相色谱检测空肠弯曲菌

目的应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌的快速检测方法。方法以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因为靶基因,选择2对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌的多重PCR体系,扩增产物分别为287bp、159 bp。采用22株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到10 pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24 h可被检出。结果在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性。结论本研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌的快速检测。

变性高效液相色谱法及其在基因变异检测中的研究进展

变性高效液相色谱法是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法。由于该技术具有快速、经济、准确和自动化程度高等特点,广泛用于单核苷多态的筛检中。本文简述了变性高效液相色谱法的基本原理,并将它与各种 SNP 筛检技术进行系统比较,综述了 DHPLC 在这一领域的最新研究进展。

一种基于变性高效液相色谱技术筛选单核苷酸多态性并估算基因频率的方法

选取生产性能具有明显差异的4个鸡品种(莱航鸡、隐性白洛克鸡、丝羽乌骨鸡和杏花鸡)为材料,利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测鸡生长激素基因部分序列(518bp)的多态性,快速筛查到5个可能与生产性能相关的单核苷酸多态性(SNPs).根据DHPLC杂合谱型与测序基因型一一对应的关系,介绍了当所检测目的DNA片段中含有多个SNPs时基因频率估算的简单方法,比较估算的和PCR RFLP统计的基因频率,发现差异不显著,证明该估算方法有一定的可行性.

变性高效液相色谱分析猪GH基因单核苷酸多态性及与生产性能的关系

选取参考家系资源群体共357个个体作为试验材料,采用变性高效液相色谱(DHPLC)技术,在猪生长激素(GH)基因包含第5外显子区的572 bp序列进行未知SNPs的筛选,对有变异的色谱峰型进行分类、测序,结果发现在该区域有4处变异,其中+1579位点的变异可以用基因型频率(AA、AB、BB)和基因频率来估算。对该位点变异与生产性能进行相关性分析得到不同基因型个体与参考家系中的测定重、体长、体高、胸宽、胸围、腿臀围、胴体A、B、C点膘厚、平均膘厚等生产性能之间没有显著差异;但BB基因型个体的测定重、体长、体高、胸宽、胸围都高于AA和AB基因型个体;BB基因型个体的腿臀围、胴体A、B、C点膘厚及平均膘厚则均低于AA和AB基因型个体;BB基因型个体的断奶后日增重显著高于AB基因型个体(P<0.05),也高于AA基因型个体,但差异未达到显著水平;BB基因型个体达100 kg日龄显著低于AB基因型个体(P<0.05),比AA基因型个体达100 kg日龄也低,但它们之间的差异不显著。

中国南北方食管癌患者中p53基因外显子突变谱的差异研究

目的探讨南北方食管癌患者中抑癌基因p53全部编码外显子基因突变谱的差异。方法各选取揭阳居民食管癌患者42例,佛山患者52例,常规提取DNA,PCR扩增p53第2-11外显子全部编码区和附近的一部分非编码区,扩增产物用DHPLC进行突变的筛查。筛查出的突变样本进行DNA纯化测序分析,测序结果在NCBI网站进行p53突变位点的比对和定位。结果高、低发区组中p53至少有1个外显子基因突变的突变率分别为63.8%(28/42)和61.5%(32/52),两者比较差异无统计学意义(P=0.607>0.05);p53有2个外显子基因突变的突变率分别为14.3%(6/42)和15.4%(8/52),两者比较差异也无统计学意义(P=0.881>0.05)。结论高低发区间可能具有相似的环境致癌物质,通过相同的p53基因突变机制导致了两地食管癌的发生。

变性高效液相色谱在微生物基因检测中的应用研究进展

变性高效液相色谱(D enaturing H ighP-erform ance Liquid Chrom atography,D H PLC)是一种可以对核酸片段进行灵敏、快速的分析,并检测出单碱基错配及插入缺失的新技术,在生命科学许多领域有广泛的应用.对D H PLC在致病微生物基因抗药性突变检测、基因型分析等领域的应用研究进展进行了综述.

变性高效液相色谱在动物检疫领域的应用前景

变性高效液相色谱是近年来发展起来的一种广泛应用于检测基因突变以及核酸多态性的新技术,具有易普及、经济、快速、高通量、自动化程度高等特点。本文对该项技术在动物传染病、寄生虫病的检疫方面的应用前景进行了评述。

变性高效液相色谱法分析中国人非小细胞肺癌、结直肠癌中表皮生长因子受体突变情况和临床意义

目的初步了解我国NSCLC和结直肠癌患者EGFR突变的发生率及与此相关的临床特征。方法利用含有野生型和突变型EGFR基因的质粒DNA,摸索条件,建立DHPLC最佳检测方法;收集北京协和医院近期NSCLC手术标本和结直肠癌的石蜡标本,通过PCR和DHPLC筛查突变,测序验证,并对结果进行统计学分析。结果在29例NSCLC标本中,8例发生突变,突变率为27·6%,其中6例为缺失突变、1例为点突变、1例为混合突变;8例女性中有7例发现突变,突变率为87·5%,而21例男性病人中只有1例发生突变,突变发生率为4·8%(P<0·001);8例无吸烟史的病人全部突变,突变发生率为100%,21例有吸烟史的病人无1例突变(P<0·001);20例腺癌病人中有8例突变,突变率为40·0%;9例鳞癌病人无一突变(P=0·026);肿瘤家族史和肿瘤分期则与突变无关。在37例结直肠癌标本中,未发现突变。结论中国人NSCLC的EGFR突变发生率明显高于欧美国家,且以19外显子上的缺失突变为主。突变发生与女性、无吸烟史和腺癌有相关性,与肿瘤家族史和肿瘤分期没有相关性。结直肠癌EGFR未发现突变。DHPLC可作为EGFR突变筛查方法。