弓形虫GRA4和SAG2基因重组BCG疫苗免疫保护性的比较研究

目的比较弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)基因和表面抗原2(SAG2)基因的重组卡介苗(BCG)对小鼠的免疫保护效果。方法108只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成6组:PBS组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组,每组18只。每鼠分别注射对应液体/疫苗100μl,共2次,间隔2周。接种前尾静脉采血,接种后4、6、8周每组分别剖杀3只,取脾和眼眶血检测细胞因子、IgG与IgM抗体,T淋巴细胞亚群计数,淋巴细胞转化率等。末次免疫后3周,每组剩余小鼠分别腹腔接种RH株弓形虫速殖子50个进行攻击感染,观察各组小鼠存活时间。结果弓形虫SAG2和GRA4重组BCG疫苗均能诱导小鼠产生免疫应答。第4周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值最高,为14.06%±1.17%。第6周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的IgG抗体水平最高,为0.18±0.02。第8周时,BCG-SAG2免疫组小鼠的IgM抗体水平最高,为0.82±0.05;弓形虫速殖子攻击后,BCG-SAG2组平均存活8.61d,PBS对照组平均存活7.33d,3个免疫组小鼠比其他3组的平均存活时间长1d。结论弓形虫重组BCG疫苗具有一定的免疫保护性。

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞,RT-PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA2经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确;转染GRA2基因的细胞,RT-PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA2,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。

弓形虫SAG2和GRA2基因疫苗的免疫保护研究

DNA疫苗是将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组体，直接接种机体，在接种部位摄取表达并达到抗感染目的的一种疫苗。pCMV—Taq2B载体具有人巨细胞病毒（Humancytomcgalovirus，CMV）高效启动子／增强子序列，可使目的基因在真核细胞中高水平稳定表达成为DNA疫苗载体。构建pCMV-Taq2B—Surfaceantigen2（表面膜抗原2）（pSAG2）、pCMV—Taq2B—Densegranuleprotein2（致密颗粒蛋白2）（pGRA2）及pCMV．Taq2B—SAG2．GRA2（pSAG2-GRA2）DNA疫苗并研究其免疫保护效果。将pSAG2、pGRA2、pSAG2-GRA2DNA疫苗（实验组）、磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline，PBS）、pCMV—Taq2B空质粒（对照组）分别肌肉注射BALB／c小鼠，ELISA法检测血清IgG抗体水平。末次免疫后第28d，各组每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子1000个，观察小鼠的生存时间。结果显示单基因疫苗pSAG2、pGRA2和双基因疫苗pSAG2一GRA2免疫组均能诱导产生特异性IgG抗体，且于末次免疫后第28d达到最高值，此时单基因疫苗pGRA2（0．382±0．66）和双基因疫苗pSAG2-GRA2（0．548±0．137）免疫组吸光度值显著高于PBS（0．137±0．016）或pCMV—Taq2B（0．135±0．010）对照组吸光度值。免疫单基因疫苗pSAG2（14．3±1．8）、pGRA2组（13．5±2．1）小鼠存活时间（d）明显长于PBS（4．3±1．6）及pCMV—Taq2B组（4．1±1．3），且双基因疫苗pSAG2．GRA2组（19．6±2．4）小鼠存活时间明显长于单基因疫苗pSAG2组及pGRA2组。弓形虫双基因疫苗pSAG2-GRA2能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫，其免疫保护性优于pSAG2、pGRA2单基因疫苗。

仁术健胃颗粒对胃癌前病变患者胃黏膜癌胚抗原、环氧合酶2的影响

目的探讨仁术健脾颗粒治疗胃癌前病变(PLGC)的疗效和作用机理。方法将58例慢性萎缩性胃炎伴肠化和(或)异型增生患者随机分为治疗组与对照组各29例,治疗组给予仁术健胃颗粒,对照组给予胃复春片治疗。观察两组患者治疗前后胃黏膜癌胚抗原(CEA)、环氧合酶2(COX-2)的阳性细胞数。结果两组患者胃黏膜CEA、COX-2的阳性细胞积分均较治疗前明显降低(P<0.05),但治疗后两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论仁术健胃颗粒能显著改善PLGC患者胃黏膜CEA、COX-2的水平。

miR-223/Fosl2/NGP调控非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝纤维化作用

目的探讨miR-223/FOS样抗原2(Fosl2)/中性粒细胞颗粒蛋白(NGP)通路调控非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝纤维化的作用。方法将60只小鼠随机分成正常组、蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)组、MCD+miR-NC组(MCD模型鼠经尾静脉注射120 nmol/kg miR-NC 100μL)和MCD+miR-223 mimic组(MCD模型鼠经尾静脉注射120 nmol/kg miR-223 mimic 100μL),每组15只。正常组给予普通饲料,其余组给予MCD饲料。酶联免疫吸附法检测4组小鼠血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平;采用放射免疫分析法检测小鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C);实时荧光定量PCR检测miR-223和Fosl2 mRNA水平;观察小鼠肝脏病理变化;Western blot检测肝组织Fosl2、NGP蛋白水平。结果与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组中miR-223表达水平升高,Fosl2表达水平下降(P<0.05)。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组肝细胞空泡化现象减少,肝细胞肥大程度降低。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组TC、TG、ALT和AST水平下降(P<0.05)。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组中脂质滴减少(P<0.05)。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组HA、LN和Ⅳ-C水平降低(P<0.05)。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组Fosl2蛋白水平下降,NGP蛋白水平上升(P<0.05)。结论miR-223可能通过调控Fosl2/NGP通路减轻NASH小鼠肝纤维化程度。

弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4(GRA4)基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4,重组耻垢分枝杆菌,鉴定重组蛋白的抗原性。方法用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因,克隆入pGEM-T载体,然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠,Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4,Western blot分析显示,GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别,分子质量单位约为40.0 ku。结论重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4,具有抗原性,刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体,为弓形虫重组BCG(Bacillus Calmette-Guerin)疫苗的研究奠定了基础。

萎胃颗粒对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜Bcl-2和PCNA表达的影响

目的探讨萎胃颗粒治疗慢性萎缩性胃炎(CAG)的可能作用机制。方法将50只SD大鼠随机分为正常组、模型组和萎胃颗粒低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余各组大鼠复制CAG模型,造模后正常组和模型组给予10ml/kg自来水灌胃,萎胃颗粒低、中、高剂量组分别给予萎胃颗粒1.8、3.6、7.2g/d灌胃,共连续12周。采用免疫组织化学方法检验各组大鼠胃黏膜增殖细胞核抗原(PCNA)和抑凋亡基因(Bcl-2)表达。结果与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜Bcl-2、PCNA表达显著增多(P<0.01);与模型组比较,萎胃颗粒各治疗组Bcl-2均有明显下降(P<0.01);与萎胃颗粒低剂量组比较,中剂量组Bcl-2下降(P<0.01);与萎胃颗粒中剂量组比较,高剂量组Bcl-2下降(P<0.01)。与模型组比较,萎胃颗粒各治疗组的PCNA阳性表达率均有明显下降(P<0.01);与萎胃颗粒低剂量组比较,中剂量组阳性表达率下降(P<0.01);与萎胃颗粒中剂量组比较,高剂量组阳性表达率下降(P<0.01)。结论萎胃颗粒可能通过抑制CAG大鼠胃黏膜Bcl-2和PCNA的表达,调节细胞的增殖和凋亡,从而改善CAG胃黏膜病变。

清肺承气颗粒对重症急性胰腺炎患者感染期免疫反应的影响

目的观察清肺承气颗粒对重症急性胰腺炎(SAP)患者感染期免疫反应的影响。方法将72例确诊为SAP感染期的患者随机分为对照组33例和观察组39例;对照组给予西医常规治疗+安慰剂,观察组给予西医常规治疗+清肺承气颗粒,疗程为7 d。分别于第1、3、7天,检测患者外周血CD+14单核细胞人类白细胞抗原DR位点(HLA-DR)、T辅助淋巴细胞1/2(Th1/Th2)、自然调节性T细胞(Treg)。结果 28 d内观察组死亡2例(5.13%),对照组死亡7例(21.21%),P<0.05。两组第1、3天外周血HLA-DR、Th1/Th2、Treg比较,P均>0.05。第7天,观察组外周血HLA-DR、Th1/Th2、Treg分别为87.02%±15.94%、5.96±6.12、4.58%±3.67%,对照分别为51.01%±33.90%、2.53±1.74、8.87%±6.19%;两组比较,P<0.01、0.05、0.05。结论清肺承气颗粒可减轻SAP感染期患者免疫抑制、促进免疫恢复,从而降低患者的病死率。

清肺承气颗粒对早期重症急性胰腺炎的影响

目的:观察清肺承气颗粒对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)早期免疫反应的影响,及对病死率的影响.方法:68例确诊为SAP早期的患者,随机分为观察组和对照组;观察组给予西医常规治疗+清肺承气颗粒,对照组给予西医常规治疗+安慰剂.分别于第1、3、7、14天,检测患者外周血人类白细胞抗原DR位点(human leukocyte antigen DR site,HLA-DR)表达率、T辅助淋巴细胞1/2(the helper T lymphocyte 1/2,Th1/Th2)、自然调节性T细胞(the regulatory T lymphocyte,Treg).结果:28 d内患者死亡9例(13.24%),其中观察组死亡3例(9.09%),对照组死亡6例(17.14%).观察组与对照组相比,HLA-DR表达率在第7、14天显著升高(86.77%±17.39%vs 65.46%±28.72%和85.43%±20.36%vs 73.32%±29.03%,P<0.05),Th1/Th2在第7、14天显著降低(3.58±3.74 vs 4.62±2.69和3.54±2.65vs 5.64±2.34,P<0.05),Treg阳性率在第3、7天显著升高(9.37%±5.61%vs 5.65%±3.75%和9.10%±6.86%vs 7.09%±4.80%,P<0.05).与观察组本组患者入组时相比,HLA-DR表达率第7、14天明显升高(86.77%±17.39%vs 67.71%±28.63%和85.43%±20.36%vs67.71%±28.63%,P<0.05),Th1/Th2在第7、14天显著降低(3.58±3.74 vs 5.96±6.12和3.54±2.65 vs 5.96±6.12,P<0.05),Treg阳性率在第3、7天显著升高(9.37%±5.61%vs 6.11%±4.08%和9.10%±6.86%vs 6.11%±4.08%,P<0.05),与对照组本组患者入组时相比,HLA-DR表达率在第14天显著升高(73.32%±29.03%vs 61.71%±28.77%,P<0.05).结论:清肺承气颗粒可能增强SAP早期的抗原呈递,增强免疫应答的启动,降低免疫抑制;同时可能通过Treg细胞的高表达来促进Th1向Th2细胞转化,减轻炎症反应对机体的损害来降低病死率.

血小板激活时胞质游离钙浓度与两种颗粒数变化的相关性

用电镜形态计量法检测血小板α颗粒（αG）和致密颗粒（dG）的数密度，用钙荧光指示剂Fura2检测血小板胞质游离Ca2+浓度（[Ca2+]i），观察到在钙离子导体A23187作用下，血小板[Ca2+]i明显升高。凝血酶与ADP也都分别引起[Ca2+]i升高，且有浓度依赖性。选用三种激动剂的不同量以反映血小板不同程度激活时，测定[Ca2+]i与颗粒数密度，分析两者间的相关性，发现αG和dG的数密度都与[Ca2+]；有紧密的相关性（Pr（αG）＜0．05，pr（dG）＜0.01），说明血小板的[Ca2+]i升高可促进αG和dG内容的分泌。

消痞颗粒对慢性萎缩性胃炎伴不典型增生大鼠胃黏膜增殖和凋亡的影响

目的探讨慢性萎缩性胃炎伴不典型增生的发病机制及消痞颗粒对其作用的机制。方法将60只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、自然恢复组、消痞颗粒组、维酶素组,每组12只。采用幽门弹簧插入术加灌胃高盐热糊法复制大鼠模型,正常组、模型组于第16周造模成功后处死;消痞颗粒组大鼠于手术1周后,给予浓度为0.6g/ml的消痞颗粒溶液灌胃0.5ml/(100g.d);自然恢复组大鼠于造模16周后,蒸馏水灌胃0.5ml/(100g.d);维酶素组大鼠手术1周后,以浓度为0.4g/ml维霉素混悬液0.5ml/(100g.d)灌胃,各组均每周灌胃6天,12周后采用免疫组化法检测胃黏膜增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果模型组与自然恢复组PCNA阳性细胞面密度、Bcl-2均明显高于正常组(P<0.05或P<0.01);Bax低于正常组(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,其余各组PCNA阳性细胞面密度差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。消痞颗粒组PCNA面密度明显低于自然恢复组(P<0.05),消痞颗粒组与维酶素组比较差异无统计学意义(P>0.05)。消痞颗粒组Bcl-2较模型组明显减弱(P<0.05),Bax明显升高(P<0.01);消痞颗粒组与维酶素组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论降低胃癌癌前病变大鼠胃黏膜中的PCNA、Bcl-2表达、升高Bax表达可能是消痞颗粒改善慢性萎缩性胃炎伴不典型增生有效机制之一。