基于Keap1/Nrf2/ARE信号通路探讨高良姜总黄酮对铅诱导HK-2细胞损伤的保护作用

目的 探讨高良姜总黄酮对铅(Pb)诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)细胞损伤的保护作用。方法 体外培养HK-2细胞,MTT法检测不同质量浓度高良姜总黄酮和Pb对HK-2细胞活力的影响。设置对照组、高良姜总黄酮对照组、模型组和高良姜总黄酮组,除对照组和高良姜总黄酮对照组外各组均给予200μmol/L Pb诱导细胞损伤,同时高良姜总黄酮对照组和高良姜总黄酮组给予100μg/mL高良姜总黄酮干预24 h。通过Hoechst 33258荧光染色法联合annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜法观察Pb诱导及高良姜总黄酮干预对细胞内ROS水平的影响,试剂盒法检测细胞内氧化应激指标ROS、MDA、GSH水平和GSH-Px、CAT、SOD活性,ELISA法检测细胞培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平,Western bolt法检测细胞Keap1/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白及caspase-3蛋白表达。结果 与对照组比较,高良姜总黄酮(12.5~200μg/mL)对HK-2细胞活力没有显著影响。与模型组比较,高良姜总黄酮可减少Pb诱导HK-2细胞的凋亡(P<0.05),减轻细胞皱缩等细胞凋亡形态学变化,上调细胞内SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH水平(P<0.05),降低细胞内MDA、ROS水平(P<0.05),上调Keap1/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白及caspase-3蛋白表达(P<0.05)。结论 高良姜总黄酮可能通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路相关蛋白表达,对Pb诱导HK-2细胞损伤起保护作用。

薯蓣皂苷通过GSK3β/Nrf2/HO-1通路改善尿酸诱导的HK-2细胞氧化应激损伤的作用及机制研究

目的探讨薯蓣皂苷(dioscin)对尿酸(uric acid,UA)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)氧化应激损伤的影响及分子机制。方法将HK-2细胞分为正常组、模型组(尿酸刺激造模)、条件对照组(尿酸+DMSO)和薯蓣皂苷组(尿酸+薯蓣皂苷)。通过尿酸诱导HK-2细胞氧化应激损伤模型;采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞技术检测细胞活性氧(ROS)水平,Real-time PCR法检测糖原合成激酶3(GSK3β)、核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶1(HO-1)在mRNA水平的表达,Western Blot法检测GSK3β、磷酸化糖原合成激酶3(p-GSK3β)、Nrf2及HO-1在蛋白水平的表达。结果经尿酸刺激后,HK-2细胞的活力明显下降,ROS水平明显升高(均P<0.001)。经薯蓣皂苷治疗后,HK-2细胞的活力增加,ROS水平明显降低(均P<0.001)。在蛋白及mRNA水平上,尿酸刺激后Nrf2和HO-1的表达均下降,薯蓣皂苷干预后Nrf2和HO-1表达均明显增加(均P<0.001)。在蛋白水平上,模型组细胞p-GSK3β/GSK3β比值较正常组明显下降,经薯蓣皂苷干预后p-GSK3β/GSK3β比值升高(均P<0.001)。结论薯蓣皂苷可能是通过促进GSK3β的磷酸化,激活Nrf2/HO-1通路,从而缓解尿酸诱导的HK-2细胞氧化应激损伤。

miRNA-30b-3p靶向ZNRF1调控草酸钠诱导的HK-2细胞凋亡和氧化应激的研究

目的探索miRNA-30b-3p靶向ZNRF1调控草酸钠诱导的HK-2细胞凋亡和氧化应激的研究并探讨其作用机制。方法将0.2、0.6μmol/L的草酸钠处理HK-2细胞,miR-30b-3p mimic和miR-30b-3p inhibitor及其相对应的对照物转染到HK-2细胞,CCK-8、Transwell和划痕实验分别检测HK-2细胞的增殖、侵袭和迁移能力;流式细胞术测量细胞内ROS,ELISA法检测LDH、MDA、GSH活性,蛋白质印迹分析Bax、Bcl-2的表达情况;荧光素酶报告基因检测验证miRNA-30b-3p及ZNRF1之间的靶向关系;RNA免疫沉淀分析miRNA-30b-3p及ZNRF1之间的作用关系。结果草酸钠处理HK-2显著增加ROS,LDH和MDA水平,GSH含量明显降低(P<0.01),抑制HK-2细胞的增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡,与草酸钠的浓度呈现剂量依赖关系,miR-30b-3p促进草酸钠诱导对HK-2细胞的影响;靶标预测和荧光素酶测定表明ZNRF1是HK-2细胞中miR-30b-3p的直接靶标,且沉默ZNRF1逆转miR-30b-3p对草酸钠诱导的HK-2细胞损伤的影响。结论miRNA-30b-3p靶向ZNRF1促进草酸钠诱导的HK-2细胞凋亡和氧化应激,抑制其增殖、侵袭和迁移。

六味地黄汤通过miR-210/HIF-1α信号通路对CoCl_(2)诱导的HK-2细胞上皮间质转化的影响和机制研究

目的观察六味地黄汤(Liuwei Dihuang Decoction,LWDHD)调控miR-210/HIF-1α信号通路对CoCl_(2)诱导的HK-2细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT)的作用和机制。方法体外培养HK-2细胞,分对照组(N组)、模型组(M组)、LWDHD血清组(LW组)、空白血清+miR-210过表达组(LV-miR-210组)、空白血清+mi R-210沉默组(LV-antimi R-210组)、空白血清+miR-210阴性对照组(LV-miR-210 NC组)、LWDHD血清+miR-210过表达组(LW+LV-miR-210组)、LWDHD血清+mi R-210沉默组(LW+LV-anti-miR-210组)、LWDHD血清+miR-210阴性对照组(LW+LV-miR-210 NC组),除N组外,其他各组加入CoCl_(2)处理。CCK-8法检测不同浓度LWDHD、CoCl_(2)在24 h后对HK-2细胞活性的影响并选择最佳干预浓度。细胞免疫荧光和Western blot法检测各组HK-2细胞中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、β-联蛋白(β-catenin)、波形蛋白(Vimentin)、上皮钙黏素(E-cadherin)蛋白表达情况;qPCR法检测miR-210、HIF-1α、β-catenin、Vimentin m RNA表达情况。通过慢病毒感染HK-2细胞,实现miR-210的过表达和抑制,并加入CoCl_(2),观察miR-210、HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达以及LWDHD的干预作用。结果CCK-8结果显示,LWDHD、CoCl_(2)最佳干预浓度分别为10%、200μmol/L。与N组相比,M组细胞形态由铺路石样向长梭形改变,HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01),mi R-210m RNA表达升高(P<0.01),E-cadherin蛋白表达降低(P<0.01);与M组相比,LW组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01),miR-210 mRNA表达降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达升高(P<0.01)。与LV-miR-210 NC组相比,LVanti-miR-210组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01);与LV-miR-210 NC组相比,LV-miR-210组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01)。在慢病毒转染各组的基础上,加入LWDHD处理后,LWDHD可降低各组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。结论LWDHD抗纤维化作用机制与其下调miR-210/HIF-1α信号通路,抑制肾小管EMT有关。

芍药苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化及PI3K/AKT通路的影响

目的探讨芍药苷(paeoniflorin,PF)对转化生长因子-β1(trans-forming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞HK-2的纤维化作用及磷酸酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositol 3 kinase and serine-threonine protein kinase,PI3K/AKT)信号通路的影响,并分析其可能的作用机制。方法将HK-2细胞分为对照组、模型组(10μg·L^(-1)TGF-β1)、PF低剂量组(20μMPF+10μg·L^(-1)TGF-β1)、PF高剂量组(80μM PF+10μg·L^(-1)TGF-β1)。细胞毒性实验(cell counting kit-8,CCK-8)检测TGF-β1和PF对HK-2细胞活力的影响。蛋白免疫印迹(Western blot)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、上皮钙黏素(epithelial cadherin,E-cad)及通路相关蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的表达。结果与对照组比较,模型组细胞α-SMA、p-PI3K、p-AKT蛋白表达升高(P<0.05或<0.01),E-cad表达降低(P<0.05);与模型组比较,PF组E-cad表达升高(P<0.05),α-SMA、p-PI3K、p-AKT表达降低(P<0.05或<0.01)。结论PF可减轻TGF-β1诱导的肾纤维化,其机制可能与调控PI3K/AKT信号通路有关。

人工虫草菌HK-1与天然虫草提取物的抗肿瘤活性比较

目的比较人工虫草菌HK-1与天然虫草提取物抗肿瘤活性及主要化学成分。方法人工虫草菌HK-1与天然虫草分别用石油醚、醋酸乙酯、乙醇和水提取。用MTT法测定各提取物对小鼠黑色素瘤细胞B16、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7和类前骨髓白血病细胞HL-60的细胞毒作用。对活性提取物进一步用动物模型检测其体内抗肿瘤作用。高效液相色谱法测定提取物中的化学成分。结果对于小鼠黑色素瘤细胞B16,所有虫草菌HK-1提取物的细胞毒作用均比天然虫草提取物的作用强,其中以醋酸乙酯提取物的细胞毒作用最强。虫草菌HK-1醋酸乙酯提取物对4种肿瘤细胞的细胞毒作用均比天然虫草醋酸乙酯提取物的作用强;体内实验也表明虫草菌HK-1醋酸乙酯提取物可以抑制肿瘤的生长。对提取物化学成分的分析表明麦角甾醇和腺苷可能是虫草菌HK-1中具有抗肿瘤活性的成分。结论人工虫草菌HK-1比天然虫草具有更强的抗肿瘤活性,是有开发潜力的抗肿瘤候选药物。

三七总皂苷对TGF-β_1诱导的HK-2细胞表型转分化的影响

目的:探讨三七总皂苷(PNS)对转化生长因子- β1(TGF - β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK - 2 )转分化的影响。方法:采用流式细胞仪(FCM )结合免疫荧光法(IF)检测PNS对TGF - β1诱导的HK - 2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性细胞百分率的影响;逆转录-聚合酶链反应(RT -PCR)检测PNS对TGF - β1诱导的HK - 2细胞α-SMA信使核糖核酸(mRNA)表达。结果:流式细胞仪(FCM )结合免疫荧光法(IF)示:PNS 2 0 0～80 0mg/L可使TGF - β1诱导的HK - 2细胞增加的α-SMA阳性细胞百分率回降;RT -PCR示:PNS 2 0 0～80 0mg/L剂量和时间依赖性地使TGF - β1诱导的HK - 2细胞增加的α-SMAmRNA的基因表达回降。结论:PNS可通过抑制TGF - β1诱导的肾小管上皮细胞表型转分化,从而参与延缓肾间质纤维化的进程。

硫化氢对TGF-β1诱导的HK-2细胞上皮间充质转化的抑制作用

目的:观察硫化氢(H2S)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人近端肾小管上皮细胞转分化的影响,并初步探讨其作用的可能机制。方法:以体外培养的HK-2细胞为研究对象,分别用10μg/LTGF-β1、100μmol/LNaHS(H2S的供体)及2者联合作用进行干预,以正常培养的细胞作正常对照。孵育0、15、30及60min后,Westernblot检测4组细胞磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)和Smad2蛋白的表达;孵育48h后,观察细胞形态变化,Westernblot检测4组细胞E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,TGF-β1组细胞发生梭形变,E-cadherin蛋白表达下降(F=1262.535,P<0.001),α-SMA蛋白表达上调(F=1456.030,P<0.001);NaHS+TGF-β1组细胞发生梭形变的程度较TGF-β1组明显减轻,E-cadherin蛋白表达增加(F=65.330,P<0.001),α-SMA蛋白表达下降(F=288.300,P<0.001)。TGF-β1组细胞在15、30及60min时p-Smad2/3表达均较正常对照组增加,而NaHS+TGF-β1组细胞p-Smad2/3的表达较TGF-β1组降低(P<0.05)。结论:H2S可抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化,该作用可能部分通过影响Smad2/3磷酸化程度来完成。

基于NLRP3-IL-1β-NF-κB信号轴研究野菊花总黄酮对脂多糖诱导HK-2细胞炎性反应及自噬的影响

目的探究野菊花总黄酮(TFC)对脂多糖(LPS)诱导HK-2细胞炎性反应及自噬的影响,并初步探究其可能的作用机制。方法体外培养人肾小管上皮HK-2细胞,将细胞分为阴性对照(Control)组、LPS处理(LPS)组、TFC预处理(TFC)组、NLRP3激活预处理(4-MET)组、TFC联合4-MET预处理(TFC+4-MET)组。CCK-8法检测细胞增殖情况;Hoechst 33342染色观察各组细胞形态变化;免疫印迹法检测各组细胞核苷酸结合域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(Asc)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)、p-IκB、IκB、自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、LC3Ⅰ、蛋白表达情况;ELISA法检测细胞中白细胞介素(IL)-1β、IL-18水平;透射电镜观察细胞自噬情况。结果与Control组相比,LPS组细胞增殖率降低,细胞核破碎情况加重,细胞凋亡率升高,NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表达升高、IκB蛋白磷酸化水平升高,IL-1β、IL-18水平升高,LC3Ⅱ/Ⅰ水平、Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05)。与LPS组相比,TFC组细胞增殖率升高,细胞核破碎减轻,细胞凋亡率降低,NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表达降低、IκB蛋白磷酸化水平降低,IL-1β、IL-18水平降低,细胞自噬程度增加,LC3Ⅱ/Ⅰ水平、Beclin-1蛋白表达升高;4-MET组细胞增殖率降低,细胞凋亡率升高,细胞核破碎情况加重,NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表达升高、IκB蛋白磷酸化水平升高,IL-1β、IL-18水平升高,细胞自噬程度降低,LC3Ⅱ/Ⅰ水平、Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05)。TFC+4-MET组细胞增殖率、细胞自噬程度、LC3Ⅱ/Ⅰ水平、Beclin-1蛋白表达高于4-MET组,细胞核破碎情况减轻,细胞凋亡率、NLRP3、Asc、caspase-1蛋白表达、IκB蛋白磷酸化、IL-1β、IL-18水平低于4-MET组(P<0.05)。结论野菊花总黄酮可能通过抑制NLRP3-IL-1β-NF-κB信号通路活化,进而抑制脂多糖诱导HK-2细胞炎性反应,诱导细胞自噬。

厚朴提取物HK-1在5个种属肝微粒体中的代谢

目的研究厚朴抗炎有效成分(E)-5-allyl-3'-(prop-1-enyl)biphenyl-2,4'-diol(HK-1)在人、大鼠、比格犬、猴和小鼠的肝微粒体中的代谢稳定性,确定HK-1在大鼠肝微粒体中代谢表型。方法将HK-1在5个种属肝微粒体中孵育,采用UPLC-MS/MS检测方法,通过测定HK-1的剩余浓度,考察它们的代谢稳定性并外推其体内代谢清除率。化学抑制剂法鉴定在大鼠肝微粒体中HK-1的代谢表型。结果 HK-1在人、大鼠、比格犬、猴和小鼠5个种属肝微粒体中半衰期(t_(1/2))分别为9.04、7.36、2.17、4.94、18.09 min;肝微粒体中固有清除率CL_(int)分别为153.40、188.20、639.02、280.60、76.60 m L/(min·mg蛋白);体内固有清除率CL'_(int)分别为151.87、338.76、949.21、416.69、301.61 m L/(min·kg)。在大鼠肝微粒体中HK-1主要被细胞色素CYP2E1、CYP2C、CYP1A2催化代谢。结论HK-1在肝微粒体中由多种酶代谢且代谢很快,其中人肝微粒体和大鼠肝微粒体中半衰期和固有清除率相似,可将大鼠肝微粒体预估人肝微粒体不良反应的风险。

小檗碱调控NLRP3炎症小体对TGF-β1诱导HK-2细胞转分化的影响

目的:探讨小檗碱(BBR)调控NLRP3炎症小体对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的影响。方法:计算机分子对接预测BBR与NLRP3炎症小体的结合情况;采用CCK8法检测不同浓度的BBR对HK-2细胞增殖的影响;将HK-2细胞分为正常组、模型组和小檗碱低、中、高剂量组(10,25,50μmol·L^(-1)),小檗碱预孵18 h后加入TGF-β1刺激48 h,镜下观察各组细胞形态;采用Western blotting法检测E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、NOD样受体蛋白3(NLRP3)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的表达;caspase-1活性检测试剂盒检测caspase-1的酶活力;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素-1β(IL^(-1)β)的含量。结果:分子对接显示BBR与NLRP3、pro-caspase-1存在结合,可靠性较高。与正常组比较,BBR对HK-2细胞的增殖呈浓度和时间依赖性抑制(P<0.05)。与模型组比较,BBR(10,25,50μmol·L^(-1))可改善HK-2细胞形态,使其趋向椭圆形;上调E-cadherin蛋白和下调α-SMA、NLRP3及caspase-1蛋白的表达(P<0.05);并可降低caspase-1的酶活力、减少IL^(-1)β的分泌(P<0.05)。结论:BBR能改善TGF-β1诱导HK-2细胞的转分化,可能与抑制NLRP3炎症小体活化有关。

全氟辛酸对HK-2细胞的毒性及对α-酮戊二酸盐受体1表达的影响

目的:研究全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)对HK-2细胞的毒性,及其对α-酮戊二酸盐受体1(oxoglutarate receptor 1,OXGR1)表达的影响。方法:采用MTT法检测不同浓度(0、0.1、1、10、100、1 000μmol/L)PFOA对HK-2细胞增殖的影响。RT-PCR法检测0、100、300μmol/L PFOA对HK-2细胞中OXGR1、琥珀酸盐受体1(succinate receptor 1,SUCNR1)、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)mRNA表达的影响。当PFOA为300或0μmol/L时,采用MTT法检测不同浓度(0、1、10、100、1 000、10 000μmol/L)OXGR1配基α-酮戊二酸钠(α-ketoglutarate sodium,AKG)对HK-2细胞增殖的影响。流式细胞术检测300μmol/L PFOA和100μmol/L AKG共同作用HK-2细胞48 h后细胞的凋亡情况。结果:在培养24 h条件下,PFOA达1 000μmol/L时可表现出毒性作用(P<0.01)。在培养48或72 h条件下,PFOA≥100μmol/L时表现出毒性作用(P<0.01)。RT-PCR结果显示,PFOA可上调HK-2细胞中OXGR1 mRNA表达(P<0.01),但对SUCNR1及HIF-1αmRNA表达无明显影响(P>0.05)。MTT及流式细胞术检测结果显示,AKG与PFOA可协同作用抑制HK-2细胞增殖(P<0.01)并诱导细胞凋亡(P<0.05)。结论:PFOA对HK-2细胞具有增殖抑制作用,并可上调细胞OXGR1 mRNA表达;PFOA可诱发HK-2细胞凋亡;AKG可与PFOA产生协同作用,该协同作用可能与OXGR1有关。

基于Smads信号通路探讨止消通脉宁干预TGF-β_1诱导HK-2细胞转分化的研究

目的:探讨止消通脉宁含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化Smad信号通路的影响。方法:将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养;实验分为6组:空白对照组、单纯TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL+10%空白血清)、中药含药血清低剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清中剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清高剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁含药血清)。药物干预24小时后,荧光定量PCR检测TβRI、TβRⅡ的mRNA表达,Western blot检测Smad 2、Smad 3的蛋白表达。结果:HK-2细胞经TGF-β1诱导后,TβRI、TβRⅡ的mRNA表达和Smad 2、Smad 3的蛋白表达显著上升,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),经止消通脉宁含药血清干预后,其表达逐步下降,与单纯TGF-β1诱导组相比差异有统计学意义(P<0.05)。而空白血清无此作用。结论:止消通脉宁能够调控TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化Smad信号通路,在一定程度上具有抑制肾间质纤维化的作用。

肾损伤因子-1在脂多糖诱导的HK-2细胞炎症反应中的作用

目的:分析肾损伤因子-1(KIM-1)在脂多糖(LPS)诱导HK-2细胞炎症模型中的表达并探讨其可能参与的生物学进程。方法:LPS刺激人肾小管上皮HK-2细胞诱导细胞炎症模型,CCK-8比色法分析LPS对HK-2细胞株体外生长的抑制作用;RT-PCR和Western blot实验分析KIM-1在正常组和LPS诱导组中的表达差异;设计siRNA靶向干扰KIM-1基因的表达,分析其对LPS诱导下HK-2细胞生长抑制作用的影响;Hoechst33342/PI双染法分析LPS诱导下对照组和siRNA干扰组细胞凋亡的影响。结果:50、100 μg/mL终浓度的LPS处理24 h 和48 h后能抑制HK-2细胞增殖,与对照组比差异有统计学意义(P<0.05);KIM-1和IL-6基因和蛋白表达水平在LPS处理组中较对照组明显上调,且具有浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);LPS处理组中Hoechst33342染色阳性细胞比例明显高于对照组;siRNA转染组中KIM-1和IL-6基因和蛋白表达水平均明显低于siRNA-NC组,在LPS作用下siRNA转染组HK-2细胞增殖率明显高于siRNA-NC组,差异有统计学意义(P<0.05);在siRNA转染组中,Hoechst33342染色强度均低于siRNA-NC组,提示靶向KIM-1基因siRNA转染可以抑制LPS诱导的细胞凋亡作用。结论:LPS可以诱导HK-2细胞增殖受抑和凋亡,并且上调KIM-1和IL-6基因表达;KIM-1可能通过调节细胞凋亡和生长抑制过程参与细胞炎症反应。

沙格列汀抑制NF-κB信号通路下调LPS诱导的人肾小管上皮HK-2细胞MCP-1的表达

目的探讨二肽基肽酶4(DPP-4)竞争性抑制剂沙格列汀(saxagliptin)对脂多糖(LPS)诱导状态下人肾小管上皮HK-2细胞MCP-1表达的调节作用及相关的分子机制。方法将人肾小管上皮细胞HK-2细胞分为3组,分别为对照组(Control组)、LPS+沙格列汀(LPS+SAX组)和LPS组。在干预12小时后使用RT-PCR法和western blot法对HK-2细胞MCP-1mRNA和蛋白的表达水平进行检测;并使用western blot法对HK-2细胞NF-κB p65活化水平(phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)进行分析。结果与Control组相比较,在LPS干预12小时后HK-2细胞MCP-1mRNA和蛋白的表达水平以及phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);但LPS组较LPS+SAX组MCP-1mRNA和蛋白的表达的升高以及phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值的增加更加显著,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 DPP-4抑制剂沙格列汀可以通过抑制NF-κB的磷酸化下调LPS诱导的人肾小管上皮HK-2细胞MCP-1合成和释放并对其产生保护作用。

糖耐康对TGF-β_1诱导的HK-2细胞VEGF mRNA表达的影响

目的:通过观察糖耐康药物血清干预转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达,进一步探讨其在防治肾间质纤维化方面的作用。方法:将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养;实验分为6组:空白对照组、单纯TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL+10%空白血清)、干预1组(TGF-β110 ng/mL+5%糖耐康药物血清)、干预2组(TGF-β110 ng/mL+10%糖耐康药物血清)、干预3组(TGF-β110 ng/mL+20%糖耐康药物血清)。药物干预24小时后,荧光定量PCR检测VEGF mRNA的表达。结果:HK-2细胞经TGF-β1诱导后,VEGF mRNA的表达显著上升,与空白对照组相比有统计学意义(P<0.05),经糖耐康药物血清干预后,VEGF mRNA的表达逐步下降,与单纯TGF-β1诱导组相比有统计学意义(P<0.05)。结论:糖耐康能够抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞VEGF mRNA的表达,在一定程度上具有抑制肾小管上皮细胞纤维化的作用。

不同浓度胰岛素对HK-2细胞TGF-β_1表达的影响

目的 观察不同浓度胰岛素对HK- 2细胞TG- β1 表达的影响。方法 将不同浓度的胰岛素加入培养的HK- 2细胞中,用EL IS法测培养液上清液中TGF- β1 蛋白浓度,RT- PCR法测HK- 2细胞中TGF- β1 m RNA表达水平。结果 低浓度胰岛素不影响TGF-β1 表达;高浓度胰岛素在不增加TGF-β1 m RNA表达的情况下可增加HK-2细胞TGF-β1 蛋白分泌。结论 高浓度胰岛素可能在翻译后水平上调HK- 2细胞TGF-β1 表达,这种作用可能参与了糖尿病肾病肾间质纤维化过程。

糖肾1号方含药血清对高糖环境下培养的HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FNmRNA和蛋白水平的影响

[目的]观察糖肾1号方含药血清干预高糖环境下培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)中转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)mRNA和蛋白水平,初步探索糖肾1号方治疗糖尿病肾病可能的作用机制。[方法]选用HK-2细胞,分为空白组、高糖组、空白血清组、糖肾1号方含药血清低剂量组、糖肾1号方含药血清高剂量组。高糖环境下培养24 h后,进行血清干预24 h,培养48 h后收集细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平。[结果]1)与空白组相比,高糖组的TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。2)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组、糖肾1号方高剂量组TGF-β1、α-SMA、FN mRNA表达水平减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。3)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P<0.05),糖肾1号方高剂量组α-SMA、FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。4)与糖肾1号方低剂量组相比,糖肾1号方高剂量组TGF-β1、FN mRNA降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]糖肾1号方含药血清可抑制TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和α-SMA、FN蛋白表达水平,糖肾1号方高剂量组效果优于糖肾1号方低剂量组。

PGC-1α在高糖诱导的HK-2细胞凋亡中的作用

目的:探讨PGC-1α在高葡萄糖诱导的HK-2细胞凋亡中的作用及机制。方法:根据对HK-2细胞所进行的处理不同设置分组:A、对照组(5.5 mmol/L D-葡萄糖处理24 h);B、高糖组(30 mmol/L D-葡萄糖处理24 h);C、PGC-1α过表达组(PGC-1α过表达质粒转染后以30 mmol/L D-葡萄糖处理24 h);D、空质粒对照组(空质粒转染后以30 mmol/L D-葡萄糖处理24 h);采用Western Blot技术检测PGC-1α、cleaved caspase-3的表达,采用流式细胞分析技术检测线粒体膜电位(ΔΨm)的变化和细胞凋亡情况。统计分析采用SPSS20软件,P<0.05为差异有统计学意义。结果:高糖组较对照组PGC-1α表达减少,线粒体膜电位降低,cleaved caspase-3的表达增加,细胞凋亡增加(P<0.05);PGC-1α过表达组较高糖组PGC-1α表达增加,线粒体膜电位升高,cleaved caspase-3的表达减少,细胞凋亡减少(P<0.05)。结论:PGC-1α可能通过维护线粒体的功能减少高糖所致的HK-2细胞凋亡,对HK-2细胞具有保护作用。