苦荞和甜荞二氢黄酮醇4-还原酶基因(dfr)的克隆及序列分析

采用同源基因克隆的方法,以苦荞和甜荞叶片为材料,提取总RNA,经RT-PCR扩增获得其二氢黄酮醇4-还原酶基因(dfr)cDNA序列,并通过T载体克隆后测序。序列分析表明,获得了苦荞和甜荞dfr的全长cDNA编码序列,其1026bp的全长开放阅读框(ORF)均编码341个氨基酸,并具典型的dfr结构特征和功能模块。同源性分析显示,苦荞和甜荞与其他植物的dfr基因核苷酸相似性为71%～98%;根据氨基酸序列构建系统进化树表明,二者与豆科、桑科和蔷薇科聚为一类。

刺葡萄DFR基因克隆及生物信息学分析

根据葡萄DFR基因CDS序列设计刺葡萄开放阅读框(ORF)特异引物,利用RT-PCR技术克隆获得其DFR基因序列,并通过生物信息学方法分析其生物学特性。结果表明,刺葡萄DFR基因ORF序列全长1 014bp,编码337个氨基酸,命名为Vitis davidii dihydroflavonol 4-reductase gene(VdDFR),GenBank登录号为KF915803。刺葡萄DFR蛋白预测分子量为37 593.2Da,理论等电点pI为5.81,是一个跨膜亲水蛋白,无典型信号肽,不属于分泌蛋白,并且亚细胞定位主要位于细胞质中(70%);二级结构以无规则卷曲为主(52.82%),是一种mixed类蛋白;该蛋白有潜在的7个糖基化位点和16个磷酸化位点,具有NAD(P)结合位点,有NAD依赖型的表异构酶/脱氢酶的N端结构域,属于NADB_Rossmann超家族成员。核苷酸序列分析表明,刺葡萄DFR基因与美丽葡萄、山葡萄和酿酒葡萄的同源性为99%,与圆叶葡萄同源性为98%,与显齿蛇葡萄同源性为94%,进化上比较保守,利用DFR基因编码区碱基序列所建立的系统关系树与真实的植物进化基本一致。

荔枝DFR基因的克隆及其序列分析

采用同源克隆的方法从荔枝果皮中克隆得到一个二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因,该基因开放阅读框全长1062 bp,编码353个氨基酸.基因组扩增得到长度为2321 bp的片段,分析发现:该基因含有5个内含子,分别在119-255、426-1158、1353-1470、1632-1819、2013-2095 bp之间.通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与山葡萄、海棠和山竹子等果树具有较近的亲缘关系.

观赏羽衣甘蓝BoDFR基因的克隆及表达分析

为揭示羽衣甘蓝二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因调控花青素合成的功能,该研究对不同叶色羽衣甘蓝的叶片花青素含量进行测定,根据结球甘蓝DFR序列信息,利用RT-PCR技术克隆羽衣甘蓝BoDFR基因并进行实时荧光定量表达分析。结果表明:BoDFR的cDNA全长为1158 bp,编码385个氨基酸,其蛋白相对分子质量为42925.06 Da,预测亚细胞定位为细胞质;蛋白质二级结构分析表明α-螺旋和无规则卷曲为DFR蛋白的主要二级结构元件。序列比对显示DFR蛋白具有NADPH结合位点和底物结合位点,属于NADB-Rossmann超基因家族。系统进化分析表明,BoDFR与结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)DFR亲缘关系最近。花青素含量测定显示,紫叶羽衣甘蓝叶片中花青素含量最高,粉叶羽衣甘蓝含量较高,而白叶羽衣甘蓝叶片中检测不到花青素。实时荧光定量PCR分析表明,BoDFR基因表达量与花青素含量高低一致,其中紫叶羽衣甘蓝叶片中BoDFR基因的表达量最高,而白叶羽衣甘蓝心叶中仅微量表达。

番茄抗病品种吉美08 SlDFR基因的克隆与表达

【目的】克隆番茄(Solanum lycopersicum)抗病品种吉美08二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)基因,并分析枯萎病菌尖孢镰刀菌番茄专化型(Fol4287)诱导下其在番茄不同组织中的表达模式,为深入研究SlDFR基因在番茄抗病过程中的调控机制提供理论依据。【方法】采用同源克隆技术从番茄中克隆SlDFR基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测番茄根、茎、叶中SlDFR基因在枯萎病菌诱导下的表达模式。【结果】从番茄抗病栽培品种吉美08中克隆得到SlDFR基因,cDNA序列全长1659 bp,包含1个1149 bp的开放阅读框(ORF),编码379个氨基酸。SlDFR蛋白的相对分子质量为42.43 kD,等电点(pI)为6.08,是一个亲水的、稳定的酸性蛋白,亚细胞定位在高尔基体上,无信号肽和跨膜结构域,有38个磷酸化位点,其中,丝氨酸18个,苏氨酸15个,酪氨酸5个。SlDFR蛋白的二级结构中α-螺旋占37.73%,延伸链占13.98%,无规则卷曲占40.69%。系统发育进化树分析结果表明,SlDFR蛋白序列与同属茄科马铃薯(Solanum pennellii)亲缘关系较近,其次为黑果枸杞(Lycium ruthenicum)。qRT-PCR分析结果显示,SlDFR基因在番茄叶中表达量最高,在根中表达量最低。SlDFR基因在番茄根、茎、叶中表达量受番茄枯萎病菌诱导,均呈现不同程度上调,其中,在根中表达量变化最大,在叶中表达量变化较小,推测SlDFR基因的表达量与番茄枯萎病菌胁迫响应有关,且番茄根部类黄酮的合成为重要胁迫响应途径。【结论】SlDFR基因表达量受Fol4287的诱导,可能参与番茄枯萎病胁迫响应过程,且对番茄枯萎病菌的响应在番茄根部更强烈,并通过调控番茄根部黄酮类物质的合成提高根系分泌物的抑菌活性从而增强番茄对枯萎病的抗性。

芥蓝二氢黄酮醇4–还原酶基因BoaDFR的克隆与功能鉴定

以白花芥蓝‘四季粗条’为材料克隆了Boa DFR基因,Gen Bank登录号为MT472647,CDS序列长为1158 bp,编码385个氨基酸,与甘蓝型油菜、甘蓝和白菜等具有高度同源性。Boa DFR表达水平在芥蓝不同发育时期、不同器官中存在显著差异,随植株发育总体呈现先下降后上升的趋势,在幼嫩种子中表达量最高。芥蓝原生质体的亚细胞定位结果显示Boa DFR定位在细胞核上。构建了农杆菌介导的芥蓝瞬时过表达体系,将Boa DFR转入白花芥蓝‘四季粗条’和黄花芥蓝‘福州黄花’中,发现Boa DFR在两种芥蓝中均高水平表达,转基因植株叶片颜色明显变紫,花青素苷显著积累,总含量最高达461.43μg·g-1 FW,而野生型和转空载体芥蓝叶片中几乎检测不到花青素苷。通过HPLC在转基因植株叶片中共检测到8种花青素苷,均为矢车菊花青素苷,其中矢车菊–3–阿魏酰–丙二酰–槐糖苷–5–葡萄糖苷占比最高。

红花檵木LcDRF1和LcDRF2基因克隆及亚细胞定位分析

【目的】克隆红花檵木二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)基因(LcDFR1和LcDFR2),并对其进行亚细胞定位,为揭示红花檵木花青苷的分子合成机理提供理论依据。【方法】基于红花檵木转录组数据,以红花檵木叶片cDNA为模板,RT-PCR克隆LcDFR1和LcDFR2基因开放阅读框(ORF)序列,利用生物信息学软件对其进行分析,并通过烟草叶片瞬时表达方法观察蛋白的亚细胞定位情况。【结果】克隆获得的红花檵木LcDFR1和LcDFR2基因ORF序列分别为1014和993 bp,分别编码337和330个氨基酸残基。LcDFR1与LcDFR2的氨基酸序列相似性为77%,二者与其他物种DFRs氨基酸序列的相似性均较高,其中与葡萄、山核桃、拟南芥等双子叶植物的DFRs氨基酸序列相似性为64%~84%,而与单子叶植物玉米和水稻的DFRs氨基酸序列相似性为58%~61%,表明不同物种DFRs氨基酸序列具有较高的保守性。在基于DFRs氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树上,LcDFR1与牡丹和芍药的DFRs聚为一类,而LcDFR2与烟草和番茄的DFRs聚为一类。结合前人研究结果推测LcDFR1和LcDFR2的氨基酸序列中均包含保守的NADP结合域和底物结合域。但三级结构预测结果均未预测到二者的底物结合位点,也未预测到LcDFR2的NADP结合位点。LcDFR1和LcDFR2亚细胞定位于细胞质,在细胞质中行使催化功能。【结论】LcDFR1和LcDFR2在红花檵木细胞质中催化花青苷物质的生物合成,但二者在进化过程中产生底物偏好性、催化能力等功能差异。

擎天凤梨花色素合成关键基因CHS、F3'H和DFR的克隆及表达分析

擎天凤梨‘Ostsra’是一种观赏红色苞片为主的高档盆栽花卉。一般认为植物苞片的呈色物质除叶绿素外多来源于花色素,而CHS、F3'H和DFR是在花色素的合成过程中的关键酶。本研究采用采用简并引物及同源克隆法获得了881 bp的CHS基因,编码276个氨基酸的序列,GenBank登录号为KX364270;采用cDNA全长文库构建、EST批量测序及目标单克隆序列测通法,获得了F3'H和DFR基因。F3'H基因长1 176 bp,可编码325个氨基酸序列,GenBank登录号为KX364271;DFR基因长1 209 bp,可编码167个氨基酸的序列,GenBank登录号为KX364272。采用实时定量PCR法检测CHS、F3'H和DFR在‘Ostsra’苞片呈色过程中的表达变化,结果表明,3个基因在苞片变色过程中(绿苞-半红苞-全红苞)都呈现出递增的趋势,即随着苞片颜色的变深,3基因的表达量逐渐增加,全红状态时,表达量最高,而作为对照的绿叶,表达水平都是最低的。