人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达

目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,最终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+。将重组质粒LipofectamineTM2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致。RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达。结论实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制。

抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段抗体dsFv V_L链的构建、表达和鉴定

目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a(+),于工程菌BL21star(DE3)中表达及TALON柱芯亲合纯化,通过ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果dsFv VL链的Thr21替换为Cys,扩增出基因片段长约为650bp,经BL21star(DE3)菌表达出相对分子质量约为28×103的目的蛋白,与NH-LBP具有一定的结合力。结论抗体轻链中成功引入了Cys。

人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段基因的构建与表达

目的构建人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv(dsFv)抗体基因,并在原核系统中实现高效表达,制备有活性的人源抗狂犬病毒dsFv抗体片段。方法采用PCR定点突变的方法,构建抗狂犬病毒dsFv抗体的重、轻链(VH、VL)突变基因,NdeⅠ和NotⅠ双酶切后分别插入pET-22b(+)表达质粒中,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。将VL、VH包涵体蛋白经盐酸胍变性,按比例混合在复性折叠缓冲液中,使二者折叠形成dsFv抗体片段。并以其母本抗体scFv作对照,对其抗原特异性和稳定性进行初步评价。结果在VH的第44位氨基酸和VL的第100位氨基酸引入了半胱氨酸,成功构建了抗狂犬病毒dsFv抗体基因,并在原核系统中实现了对二者的高效表达,VH、VL蛋白在复性缓冲液中正确折叠形成了dsFv抗体片段。结论对筛选获得的抗狂犬病毒scFv成功进行了稳定性改构,制备了有活性的dsFv抗体片段,改构以后的dsFv保持了对狂犬病毒的特异结合活性,而其在血清中的稳定性有明显改进,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进。

抗人氨基末端脂多糖结合蛋白二硫键稳定性Fv抗体的制备及生物学活性的初步研究

目的制备抗人氨基末端脂多糖结合蛋白(N-terminal fragment of human lipopolysaccharide binding protein,NH-LBP)的二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv),并初步测定其生物学活性。方法将含有dsFv-VL与dsFvVH包涵体蛋白经复性、折叠和纯化,获得完整的dsFv抗体。通过ELISA、TNF-α分泌等方法,初步测定dsFv抗体在体内外的生物学活性。结果获得dsFv抗体蛋白约2.1mg,dsFv与NH-LBP有较好的结合能力,并在动物体内减轻了LPS所诱导的炎症反应,发挥了一定的保护活性。结论通过分别表达VL和VH片段,再制备dsFv抗体是可行的,dsFv能部分抑制LBP的生物学功能。

抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及活性分析

结合生物信息学方法与已知癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单链抗体(Single chainFv fragment,scFv)核苷酸序列,经分子设计和密码子优化后,通过化学方法合成CEA二硫键稳定性单链抗体(Disulfide stabilized single chain Fv fragments,scdsFv)基因片段.将凋亡素基因(Apoptin)通过一段柔性连接肽(Linker)连接在CEA scdsFv基因下游,并克隆入大肠杆菌表达载体质粒pET28a,转化BL21感受态菌后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,表达融合蛋白CAtin.SDS-PAGE和Western-Blot分析表明,目的蛋白得到良好表达,经条件优化后表达量最高可达44.1 mg/L.融合蛋白经分步洗涤法和谷胱甘肽对表达的目的蛋白进行初步纯化和复性后,利用人肝癌细胞(HCC)对所制备融合蛋白进行亲和力测定、细胞结合活性测定和特异性细胞杀伤活性分析.结果显示,所制备融合蛋白不仅能够有效地与上述肿瘤细胞结合,并对其具有明显的杀伤活性,表明成功制备了具有特异性识别和特异性杀伤活性的双特异抗肿瘤免疫导向制剂.

人源抗破伤风毒素单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达

目的构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并进行原核表达和生物学特性鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,获得二硫键稳定的抗破伤风毒素重链C端(TeNT-Hc)单链抗体基因(27G-scdsFv)。连接pET22b(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot法鉴定表达产物。ELISA检测27G-scdsFv体外抗原特异结合活性和抗体相对稳定性;非竞争酶免法检测抗体亲和力。采用免疫荧光法检测27G-scdsFv体外中和活性。结果测序结果显示获得正确的27G-scdsFv基因。原核表达scdsFv以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的50%。复性后的27G-scdsFv保持了与TeNT-Hc的特异结合活性,亲和力较其scFv形式略有提升,KD=0.93×10-7mol/L,1 L培养物可获得5 mg scdsFv蛋白。27G-scdsFv的稳定性较scFv形式明显增强。27G-scdsFv在体外可以明显抑制TeNT-Hc与神经元细胞的结合。结论成功构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并获得有活性的目的蛋白,为27G-scdsFv的进一步生物学功能研究奠定基础。