克氏原螯虾Dmrt1基因克隆及表达特征分析

【目的】克隆克氏原螯虾(Procambarus clarkii)Dmrt1基因(PcDmrt1),分析其在雌性和雄性克氏原螯虾不同组织中及不同发育时期性腺中的表达特征,为研究克氏原螯虾性别分化与发育提供理论依据。【方法】克隆PcDmrt1基因开放阅读框(ORF),并对其进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR检测PcDmrt1基因在雌性和雄性克氏原螯虾不同组织及不同发育时期性腺中的表达特征。【结果】PcDmrt1基因ORF长1752 bp,共编码583个氨基酸残基。PcDmrt1蛋白分子量64.9 kD,理论等电点(pI)为9.51,包含2个DM结构域。同源比对分析表明,克氏原螯虾PcDmrt1氨基酸序列与红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)Dmrt氨基酸序列同源性最高,为61.2%。基于Dmrt氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树表明,克氏原螯虾与东澳岩龙虾(Sagmariasus verreauxi)、红螯螯虾和美洲螯龙虾(Homarus americanus)亲缘关系较近。PcDmrt1基因在克氏原螯虾性腺、肝胰腺、鳃、脑、眼柄、肌肉和肠道7个组织中均有表达,性腺中相对表达量最高,肝胰腺和眼柄次之,在其他组织中相对表达量较低,在性腺、肝胰腺和眼柄3个组织中,雌性和雄性克氏原螯虾Pcdmrt1基因相对表达量存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)差异。在克氏原螯虾不同发育时期,PcDmrt1基因相对表达量在出膜后5 d出现高峰,最高表达出现在出膜后40 d,此时雄性幼虾PcDmrt1基因相对表达量极显著高于雌性幼虾。【结论】克氏原螯虾PcDmrt1蛋白含有2个DM结构域,属于典型的Dmrt家族成员,在进化上保守。PcDmrt1基因广泛表达于克氏原螯虾各组织中并在性腺中高表达,基因相对表达量在发育早期呈上升趋势,表明PcDmrt1基因可能在早期参与克氏原螯虾性别分化与组织发育。

黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠、人的同源性较低,分别为42%和44%。实时荧光定量RT-PCR分析表明:DMRT1基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的1～51d仔鱼均有表达,且在胚后发育的第31天表达量最高;在成体,只在雄性精巢中特异性表达,其他组织均无表达,且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高,表明该基因可能在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。

DMRT1单倍体不足导致性发育异常

目的增加对DMRT1基因单倍体不足导致性发育异常的认识,提高性发育异常疾病的诊断水平。方法描述1例染色体为46XY性发育异常患者的临床特点;对患者及其父母的静脉血进行淋巴细胞培养和染色体核型分析;抽取患者外周血,提取基因组DNA,进行微阵列比较基因组杂交技术(a CGH)扫描。结果 1)患者表现为女性外阴,超声未见子宫和卵巢组织;伴随发育延迟和运动迟缓;临床表现符合"9p缺失综合征";2)染色体结果:患者母亲46XX,t(7;9)(q35,p24);父亲46XY;患儿46XY,der(9)t(7;9)(q35,p24);3)a CGH扫描结果:患儿第7号染色体长臂部分(144741153-159098761)重复,长约14.37 Mb;第9号染色体短臂部分(10001-9733061)缺失,长约9.72 Mb,缺失部分包含EZH2、MNX1、DMRT1、DMRT2、SHH、SMARCA2、GLDC、VLDLR、DOCK8和GLIS3基因。结论 DMRT1在性腺发育过程中发挥重要作用。母亲染色体发生平衡易位,因无遗传物质丢失,故不导致疾病发生。在产生配体过程中,因DMRT1单倍体剂量不足,导致子代睾丸发育障碍。

河川沙塘鳢DMRT1基因的克隆及其表达分析

以河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)为研究对象,采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术对DMRT1的全长基因进行了克隆,并利用生物信息学技术分析其结构和功能;采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术检测了河川沙塘鳢DMRT1基因在8种组织(鳃、肠、心、肌肉、脑、肝、脾、性腺)、胚胎发育的8个时期(受精卵期、桑椹胚期、原肠胚期、神经胚期、体节期、口裂期、出膜后1 d和出膜后3 d)以及性腺发育的4个时期(Ⅰ~Ⅳ期)中的表达变化。结果表明,河川沙塘鳢DMRT1基因c DNA序列的全长为2025 bp,编码297个氨基酸,其中包括894 bp的开放阅读框(ORF),73 bp的5'非编码区和1058 bp的3'非编码区。与已知物种的氨基酸序列比对后发现,河川沙塘鳢DMRT1的氨基酸序列与军曹鱼(Rachycentron canadum)、欧洲鲈鱼(Dicentrarchus labrax)的同源性最高。DMRT1基因在河川沙塘鳢的精巢组织大量表达,而在卵巢、肌肉、心以及肝4种组织中表达较少,在其它组织中几乎不表达; DMRT1基因在胚胎发育的各个时期都有表达,在原肠期的表达量最高;此外,DMRT1基因表达量在精巢发育的不同时期呈先下降后上升的趋势,在精子成熟期(Ⅳ期)达到最大值,而在卵巢发育的不同时期表达量较少且表达强度差异不明显,因而推测河川沙塘鳢DMRT1基因与精巢的发生和功能的维持有关。研究结果为解析河川沙塘鳢DMRT1基因的功能及其性别决定机制提供了基础资料,也为开展河川沙塘鳢单性育种奠定了基础。

哺乳动物DMRT1基因调控区分析

dmrt1基因是迄今为止发现的第一个在种属间具有进化保守性的性别分化基因。该基因在哺乳动物的性别分化过程中发挥着重要作用。通过对哺乳动物dmrt1基因5′端和3′端调控区的分析,发现它们分别存在3个和7个同源性较高(>60%)的保守区。PCR扩增得到该基因的启动子、3′端调控区及编码区,并构入表达载体转染COS-7和ST细胞,结果显示,克隆的5′端和3′端调控区都能有效引导报告基因gfp以及dmrt1基因的表达,但表达效率在不同细胞中存在较大差异,显示dmrt1的表达存在着细胞特异性及复杂的调控机制。

斑鱾dmrt1的克隆及其表达分析

克隆了斑鱾(Girella punctata)dmrt1(doublesex and mab-3 related transcription factor 1)基因,用DNAMAN 9软件比较了Dmrt1蛋白的氨基酸同源性,用MEGAX软件构建了Dmrt1系统进化树,并应用实时荧光定量PCR方法检测dmrt1 mRNA在斑鱾雌雄性腺和不同胚胎发育阶段的表达。结果显示,斑鱾dmrt1的开放阅读框(ORF)全长894 bp,编码297个氨基酸,氨基酸序列含有典型的DM结构域。斑鱾Dmrt1氨基酸同源性比对分析发现,它与黄金鲈(Perca flavescens)的同源性最高,为85.71%;与人类(Homo sapiens)同源性最低,为32.89%。斑鱾Dmrt1与其他鲈形目鱼类在系统进化树上聚为一支,与传统分类地位一致。斑鱾dmrt1在精巢中有较高表达(P<0.05),在卵巢中微弱表达。此外在胚胎发育过程中,dmrt1的表达水平呈先升后降的趋势,在桑葚期表达水平最高(P<0.05)。综上所述,dmrt1可能参与了斑鱾性腺分化和早期胚胎发育。

红鲫DMRT1基因保守区的克隆与序列分析

目的进一步理解鱼Dmrt1基因的进化。方法利用兼并PCR技术,从红鲫基因组中克隆和测Dmrt1基因保守区的3个序列,分别命名为RcDmrt1a-1、Rc Dmrt1a-2和RcDmrt1b。结果 RcDmrt1a-1与RcDmrt1a-2、RcDmrt1b核苷酸同源性分别为92.2%、83.7%,RcDmrt1a-1与RcDmrt1a-2这2个序列的氨基酸组成完全相同。它们与RcDmrt1b的氨基酸序列有4个碱基不同。结论红鲫Dmrt1基因与斑马鱼、中国鳄、鸡、人的Dmrt1基因相比,显示了红鲫Dmrt1基因在结构上的保守性,暗示了在进化中功能的保守性。

泰国斗鱼Dmrt1基因的部分cDNA克隆及表达分析

Doublesex和Mab-3相关转录因子1(Dmrt1)隶属于DMRT家族,在脊椎动物性别决定、性别分化和性腺发育中具有重要作用。利用RACE克隆技术从泰国斗鱼脑中克隆Dmrt1基因的部分cDNA序列,分别采用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测Dmrt1基因的组织分布和胚胎发育过程的表达变化。试验结果显示,克隆的泰国斗鱼Dmrt1基因的部分cDNA序列长为1037 bp,其中开放阅读框长为798 bp,编码265个氨基酸残基;进一步构建Dmrt1系统进化树,结果显示,泰国斗鱼与龟壳攀鲈亲缘关系最近;半定量PCR和实时荧光定量PCR结果显示,Dmrt1基因的表达具有明显的组织特异性及性别差异,在雄性个体中,Dmrt1基因在精巢和脾脏中特异表达,而在雌性个体中,Dmrt1基因在心脏中高表达,其次在脑、垂体、脾脏、肌肉、肾脏和肠道中也有少量表达,但未在性腺和肝脏中表达。在胚胎发育过程中,Dmrt1基因在受精卵的表达水平最高,而在原肠胚至心跳期表达量较低。Dmrt1可能在调控泰国斗鱼的雄性个体的生殖发育过程中发挥着重要作用。

黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列克隆和报告基因载体活性分析

为深入研究黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列在性别决定与分化中细胞通路之间的转录调控作用。本研究以黄鳝基因组DNA为模板,PCR扩增出Dmrt1基因5′端侧翼序列,并对该序列进行了生物信息学分析,然后将克隆获得的Dmrt1基因5′端侧翼序列构建到PGL3-enhancer载体中,命名为pGL3-enhancer-Dmrt1,最后将pGL3-enhancer-Dmrt1和内参质粒pRL-TK共转染至HEK293细胞,采用双荧光素酶检测系统对Dmrt1基因5′端侧翼的启动活性进行了检测。实验结果显示:克隆获得的Dmrt1基因5′端侧翼序列为1519 bp;利用TESS-Transcription Element Search System转录因子结合位点在线预测数据库对黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列进行预测分析结果表明,该序列存在AP-1、Oct-1、C/EBPa和GATAx等真核生物通用的转录因子结合位点以及与性别相关基因的蛋白结合位点,如SRY、Sox3和Sox5等;双荧光素酶检测结果显示,该5′端侧翼序列具有启动活性。

半滑舌鳎DMRT 1基因的克隆与表达分析

利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的DMRT 1基因;并用RT-PCR技术检测了该基因在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼的不同组织的表达情况.结果表明,该基因cDNA序列全长1 232 bp(GenBank登录号为EU007655),包括774 bp开放阅读框,131 bp5′非翻译区以及含poly(A)信号的329 bp的3′非翻译区,编码258个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎DMRT1氨基酸序列与牙银汉鱼、黑鲷、青鳉、河豚和斑马鱼DMRT1氨基酸序列的同源性分别达到了63%、59%、54%、53%和52%;与光滑爪蟾、小鼠和人类的同源性较低分别为38%、42%和41%.RT-PCR分析表明,DMRT 1基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5、13、18、22和35 d的仔鱼均有表达,在孵化后22 d表达量最高.在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达,其他组织均无表达,表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成.

杂交三倍体泥鳅性腺发育观察及其基因表达分析

以杂交三倍体泥鳅(4 n♀×2 n♂)为研究对象,对其早期性腺分化的组织学进行观察,并采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对杂交三倍体泥鳅早期不同发育时期(孵化后4、14、21、23、50、60和65 d)和不同组织(性腺、肝脏、肌肉、肠、鳃、鳍、皮肤和脑)中性腺发育相关基因(hormad1、dmrt1-a)的表达量进行定量检测。研究结果发现:在早期不同发育时期,hormad1和dmrt1-a基因均为在4日龄中表达量最高,14日龄次之,在50日龄中表达量最低。在不同组织中,hormad1基因在雌鱼的鳍中表达量最高,肝脏中表达量最低;在雄鱼的性脑腺中表达量最高,肝脏中表达量最低。dmrt1-a基因在雌雄鱼的性腺中表达量最高,脑中表达量最低。杂交三倍体泥鳅早期性腺的分化和发生与二倍体泥鳅无差别,可观察到原始生殖细胞、原始生殖细胞的迁移和原始性腺的生成及性腺的分化等过程。研究结果表明,hormad1、dmrt1-a这2个基因与杂交三倍体泥鳅早期性腺发育密切相关。

中华鳖Dmrt1基因的克隆、表达及在性逆转中的变化分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文从m RNA和蛋白水平分析Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化,研究Dmrt1基因在中华鳖性别分化中的调控作用.Rapid-amplification of c DNA ends(RACE)结果显示,Dmrt1基因c DNA序列全长2409 bp,其中5′非编码区为230 bp,3′非编码区为1072 bp,开放阅读框为1107 bp,编码368个氨基酸,具有一个高度保守的DM结构域.荧光定量PCR和免疫组化结果显示,Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达,先于Amh和Sox9基因表达.随着性腺的发育,Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞的细胞核上,在雌性性腺发育过程中并未见其表达.此外,在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中,Dmrt1表达显著下调;在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中,Dmrt1表达则显著上升.上述研究表明,Dmrt1基因是中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别决定中起重要的调控作用.

DMRT1基因变异/单倍剂量不足与46,XY性发育异常

目的分析4例doublesex和mab-3相关转录因子1(doublesex and mab-3 related transcription factor 1,DMRT1)基因变异/单倍剂量不足所致的46,XY性发育异常(46,XY DSD)患儿的临床特征,以提高医生对此病的认识。方法回顾性收集4例46,XY DSD患儿的病史、体格检查、内分泌功能评估、性腺病理及遗传学资料。结果例1为DMRT1基因变异c.332G>T(P.Arg111Met)杂合错义新发变异,因"闭经"于15岁就诊,外生殖器男性化得分(external masculinization scores,EMS)为0分。DMRT1基因单倍剂量不足3例:9p末端依次存在1.2 Mb、5.1 Mb和6.0 Mb片段缺失,其中例3合并5p区域33.3 Mb重复。3例就诊年龄均在1岁以内,社会性别2例为女性,1例为男性,均因"外生殖器外观异常"就诊,EMS依次为1分、0分、5分。例1和例3内分泌评估提示原发性性腺功能减退,性腺病理均为完全性性腺发育不良,例2提示Leydig细胞功能良好、Sertoil细胞功能欠佳,性腺病理为混合性性腺发育不良。例3在18个月龄诊断为性腺母细胞瘤。例4患儿内分泌评估示睾丸功能正常,暂未同意活检。4例染色体核型均为46,XY。结论在DMRT1基因变异/单倍剂量不足的46,XY DSD患者中,前者初诊年龄偏大,后者就诊年龄偏小,性腺功能可表现为从正常到完全性性腺发育不良。此类患者存在性腺母细胞瘤高风险,且发病年龄小,对性腺发育不良者应及早行性腺活检。

Dmrt1基因在红耳龟温度依赖型性别决定中的功能研究

除了基因型性别决定(GSD)外,温度依赖型性别决定(TSD)是另一种重要的动物性别决定方式,但其分子机制一直是个谜团.本文以TSD动物红耳龟(Trachemys scripta)Dmrt1基因为研究对象,分析了Dmrt1蛋白在不同发育时期胚胎性腺中的表达情况和细胞定位;通过慢病毒-sh RNA干扰系统对Dmrt1在TSD中的作用进行了功能验证.免疫荧光染色结果显示,Dmrt1蛋白在性腺分化之前的第15期产雄温度(male-producing temperature,MPT)性腺中开始表达,第19期后急剧增加,定位于Sertoli前体细胞的细胞核上,在整个产雌温度(female-producing temperature,FPT)性腺发育过程中几乎检测不到信号.RNA干扰实验表明,MPT胚胎经过Dmrt1-sh RNA处理后,95.34%发育成雌性或具有卵睾丸的间性(对照组MPT胚胎100%发育成雄性个体,对照组FPT胚胎100%发育成雌性个体).Dmrt1基因敲低后,MPT胚胎性腺外形和组织结构明显雌性化,生殖细胞从髓质区向皮质区转移,雄性特异性蛋白Sox9表达显著降低(甚至消失),而雌性特异性蛋白芳香化酶则开始大量表达,呈现典型的雄性向雌性逆转现象.上述研究结果表明,Dmrt1基因在TSD中是必需的,是启动未分化性腺向雄性分化的关键因子,位于TSD分子信号通路上游.本文首次对TSD进行了关键基因的功能分析,为TSD分子机制研究开辟了一条新途径.