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鸡滑液囊支原体DnaK基因体外表达、纯化及鉴定研
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作者 张永康 徐婧祎 何生虎 《当代畜禽养殖业》 2024年第2期15-18,共4页
本试验通过对热休克蛋白(DnaK)的基因片段测序分析后,去除多余启动子、终止密码子等并进行修饰,将目的基因片段DnaK通过体外蛋白表达系统进行蛋白表达,结果得到了目的蛋白,并验证其来自上清液,大小为27.5 kDa,为下一步蛋白疫苗的制备提... 本试验通过对热休克蛋白(DnaK)的基因片段测序分析后,去除多余启动子、终止密码子等并进行修饰,将目的基因片段DnaK通过体外蛋白表达系统进行蛋白表达,结果得到了目的蛋白,并验证其来自上清液,大小为27.5 kDa,为下一步蛋白疫苗的制备提供理论依据和试验素材。 展开更多
关键词 鸡滑液囊支原体 dnak蛋白 表达 纯化 鉴定
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志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak的表达纯化与多克隆抗体的制备及应用
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作者 贾雪娇 刘梦琦 +7 位作者 刘洋 刘长城 李小凤 胡屹硕 李香雨 李润林 李永刚 赵微 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期236-242,共7页
目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dn... 目的表达轮状病毒感染的乳鼠体内志贺氏杆菌分泌蛋白Dnak(Hsp70),并制备Dnak多克隆抗体。方法以提取的志贺氏杆菌基因组为模板PCR扩增Dnak片段,与pET-24a(+)和PCDNA3.1分别连接构建原核表达质粒pET24a(+)-Dnak和真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak;pET24a(+)-Dnak原核表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经镍柱纯化Dnak蛋白。以纯化后的重组蛋白为免疫原免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测效价,Western Blot法检测灵敏度和特异性。利用制备的多克隆抗体在GST Pull-down实验中检测Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2的相互作用。真核表达质粒PCDNA3.1-Dnak转染至HEK293T细胞,以制备的DnaK多克隆抗体为一抗,Western blot法检测Dnak在细胞中的表达。利用MEGA11及Genedoc软件分析此志贺氏杆菌与志贺菌属其他细菌Dnak氨基酸序列同源性。结果重组质粒pET24a(+)-Dnak与PCDNA3.1-Dnak经测序比对包含与此志贺氏杆菌(Shigella:PRJNA804371)序列一致的基因,证明质粒构建成功。诱导表达的重组Dnak蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约为75 kDa,浓度可达0.62 mg/mL;Dnak鼠多克隆抗体可与重组Dnak蛋白发生特异性反应,效价为1∶32000,至少可以在1∶6000稀释度下检测到Dnak蛋白。GST Pull-down实验可以检测到Dnak与轮状病毒非结构蛋白Nsp2发生相互作用。转染PCDNA3.1-Dnak重组质粒的HEK293T细胞可以表达Dnak蛋白。经MEGA11和Genedoc软件比对PRJNA804371株与宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)Dnak氨基酸序列同源性较高。结论成功表达志贺氏杆菌Dnak蛋白,具有良好反应性与免疫原性;制备的鼠多克隆抗体效价及灵敏度较高可满足后续实验需要。 展开更多
关键词 志贺氏杆菌 dnak 蛋白表达与纯化 多克隆抗体 轮状病毒
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猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70(Dnak)的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析 被引量:15
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作者 李媛 张建华 +2 位作者 王亮 乔祖建 辛九庆 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期169-173,共5页
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK... 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK基因即Hsp70基因全长1 803 bp,编码600 aa,第631~633位TGA在支原体编码色氨酸而不是作为终止密码子。将该序列与多种致病支原体DnaK基因进行分析比较,发现Yin-1株与232株、J株、7 448株等MHP菌株的DNA同源性为99.3%~99.4%,氨基酸同源性为99.2%~99.3%,而与非同种支原体的DNA和氨基酸同源性仅为64.5%~74.4%和59.3%~77%。这表明DnaK基因在种内高度保守,种间差异较大。以pET28a为载体构建重组质粒,原核表达DnaK C末端大小为1 kb左右的基因,对表达的蛋白进行纯化后,通过Western blot检测它的免疫活性。原核表达得到大小为41 ku的目的蛋白,经Western blot证实,纯化蛋白可与MHP阳性猪血清反应,具有免疫活性。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪喘气病 伴侣蛋白dnak 热休克蛋白70
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猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性 被引量:7
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作者 王亮 乔祖健 +3 位作者 李媛 张建华 梁立 辛九庆 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期123-127,共5页
应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白DnakC末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6h。用BugBusterT... 应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白DnakC末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6h。用BugBusterTMNi-NTA His.Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性。 展开更多
关键词 猪肺炎霉形体 猪霉形体肺炎 P97基因 伴侣蛋白dnak 热休克蛋白70
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基于鸡毒支原体热休克蛋白DnaK的间接ELISA方法的评价及初步应用 被引量:4
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作者 王莉莉 于艳超 +6 位作者 周长平 赵雅芝 潘巧 张琳 郝文君 王秀梅 辛九庆 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期795-800,共6页
为研究鸡毒支原体(MG)重组热休克蛋白DnaK (rDnaK)的免疫反应原性及其作为ELISA方法中诊断抗原的应用价值,本研究将已构建的含有MG DnaK基因的重组质粒p ET-30a-DnaK进行原核表达纯化,以多份MG的标准阳性血清和阴性血清作为一抗,进行wes... 为研究鸡毒支原体(MG)重组热休克蛋白DnaK (rDnaK)的免疫反应原性及其作为ELISA方法中诊断抗原的应用价值,本研究将已构建的含有MG DnaK基因的重组质粒p ET-30a-DnaK进行原核表达纯化,以多份MG的标准阳性血清和阴性血清作为一抗,进行western blot分析,结果显示r DnaK与MG的阳性血清发生特异性反应,与MG的阴性血清无反应条带,表明r DnaK具有较好的免疫反应原性。将其作为包被抗原包被酶标板,用HRP标记的兔抗鸡Ig G作为酶标二抗,分别对抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度及工作时间等反应条件进行了优化,建立了一种稳定检测MG抗体的间接ELISA方法。对该方法进行评估,灵敏性试验结果显示该方法与进口试剂盒相当;特异性试验结果显示包被抗原r DnaK不与NDV、IBV、ILTV等几种常见的禽呼吸道疾病的阳性血清发生交叉反应;重复性试验结果显示,批内变异系数为1.6%~5.15%,批间变异系数为2.9%~5.98%;符合率试验结果显示该方法与进口试剂盒的总体符合率为90.4%;抗体持续期试验结果显示该方法最早能在鸡群免疫MG疫苗后一周检测到MG抗体,表明该诊断方法适用于MG感染的早期检测。采用该方法检测了来自全国5个省份的568份临床样品,其结果显示MG的感染率在23%~51%,对我国MG的流行状况做了初步的调查。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 dnak 免疫原性 间接ELISA
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绵羊肺炎支原体DnaK B细胞抗原表位预测及其蛋白结构分析 被引量:3
6
作者 王慧 罗成波 +5 位作者 贺纛 孔令萍 周碧君 文明 程振涛 王开功 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期159-164,共6页
以绵羊肺炎支原体(Mo)热休克蛋白Hsp70(DnaK蛋白)氨基酸序列为基础,运用DNAStar软件和在线服务器等生物信息学分析工具,在同源性分析的基础上,通过Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法、Karplus-Schulz法及Welling法分别预测其... 以绵羊肺炎支原体(Mo)热休克蛋白Hsp70(DnaK蛋白)氨基酸序列为基础,运用DNAStar软件和在线服务器等生物信息学分析工具,在同源性分析的基础上,通过Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法、Karplus-Schulz法及Welling法分别预测其抗原指数、亲水性、柔韧性、表面可极性等参数,综合分析、预测了该蛋白的B细胞抗原表位,并进行了蛋白的二级结构预测和3D结构模拟。结果表明,Mo贵州分离株的Hsp70蛋白与其它可致羊发病支原体的Hsp70蛋白同源性较低,说明该蛋白具有良好的特异性;Mo Hsp70蛋白整体抗原性较好,同时呈现较规则的空间结构,其中以C末端较稳定,区域也最大(第394-598区段),为优势B细胞抗原表位区域。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 dnak蛋白 蛋白结构 B细胞抗原表位
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热休克蛋白质DnaK的纯化及其二聚体性质研究 被引量:1
7
作者 刘清岱 苏家跃 +3 位作者 田雪利 杨营 赵飞 盛长忠 《天津科技大学学报》 CAS 北大核心 2016年第3期11-15,共5页
通过定点突变技术构建了两个DnaK蛋白质突变体,研究腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和腺苷二磷酸(ADP)条件对热休克蛋白质DnaK二聚体性质的影响.首先诱导表达DnaK蛋白质的两个突变体DnaK-A303C和DnaK-H541C,并采用硫酸镍亲和层析和阴离子交换层... 通过定点突变技术构建了两个DnaK蛋白质突变体,研究腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和腺苷二磷酸(ADP)条件对热休克蛋白质DnaK二聚体性质的影响.首先诱导表达DnaK蛋白质的两个突变体DnaK-A303C和DnaK-H541C,并采用硫酸镍亲和层析和阴离子交换层析对重组蛋白质进行纯化.对等量的DnaK蛋白质进行氧化交联处理,然后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测ATP、ADP对DnaK二聚体的影响.研究表明DnaK突变体在ADP的存在下以同二聚体的形式存在,但是在ATP条件下能够形成异二聚体.由此为深入认识热休克蛋白质两个亚基之间的协同作用提供了实验依据. 展开更多
关键词 dnak ATP 二聚体 突变体
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猪肺炎支原体DnaK蛋白质单抗的制备与鉴定 被引量:1
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作者 缪芬芳 王海燕 +5 位作者 白昀 刘茂军 冯志新 熊祺琰 白方方 邵国青 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第6期1361-1366,共6页
为了获得针对猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)DnaK蛋白质的单克隆抗体,利用Mhp全菌抗原免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备Mhp DnaK蛋白质的单抗。获得了3株可稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3A8、3E2及5D10。3株单... 为了获得针对猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)DnaK蛋白质的单克隆抗体,利用Mhp全菌抗原免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备Mhp DnaK蛋白质的单抗。获得了3株可稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3A8、3E2及5D10。3株单抗的Ig重链均为IgG1,轻链均为κ链。Western Blot分析结果显示,3A8与猪鼻支原体和Mhp均有反应,3E2和5D10只与Mhp反应,同时3E2和5D10能与Mhp 168株105代、J株、临床分离株XLW-1、XLW-2、XLW-3、XLW-4、AH、WX产生特异性反应。采用间接ELISA测得3株单抗腹水与DnaK重组蛋白质及Mhp 168全菌蛋白质反应效价均为1∶1 000 000。单抗3A8为针对Mhp和猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinitis,Mhr)共同抗原表位的单抗;3E2和5D10为猪肺炎支原体特异性抗体,且抗体效价高。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 dnak蛋白质 单克隆抗体
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猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立 被引量:8
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作者 刘茂军 丁志勇 +9 位作者 刘冬霞 杜海霞 缪芬芳 甘源 孔猛 冯志新 熊祺琰 白方方 杜改梅 邵国青 《金陵科技学院学报》 2011年第4期79-84,共6页
猪肺炎支原体(Mhp)是猪气喘病的主要病原体。利用Mhp NJ株的DnaK基因通过SOE-PC(splicing withoverlap extension PCR)R扩增和突变,获得了目的片段并插入表达载体pET-28a(+)中,然后转入宿主菌BL21(DE3)。重组质粒经1 mmol/L IPTG在37... 猪肺炎支原体(Mhp)是猪气喘病的主要病原体。利用Mhp NJ株的DnaK基因通过SOE-PC(splicing withoverlap extension PCR)R扩增和突变,获得了目的片段并插入表达载体pET-28a(+)中,然后转入宿主菌BL21(DE3)。重组质粒经1 mmol/L IPTG在37°C温度下诱导5 h,目的蛋白可达到总蛋白的14.1%。Western Blotting证明表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体反应原性,用该重组蛋白建立的ELISA方法可检测到猪肺炎支原体抗体。此为该病基因工程疫苗抗原的筛选和ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 dnak 重组蛋白 活性鉴定
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嗜麦芽假单胞菌热休克基因dnaK启动子的亚克隆及其在大肠杆菌中功能的研究 被引量:1
10
作者 王雅琴 《工业微生物》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期29-31,35,共4页
通过聚合酶链式反应 (PCR)得到了嗜麦芽假单胞菌 (Pseudomonasmaltophilia)热休克基因dnaK启动子的DNA片段dnaKp。将dnaKp的PCR的产物亚克隆在报道载体质粒 pUCD6 15的LuxCDABE基因上游 ,成重组的具有启动子的质粒融合体pUCD6 15 p。转... 通过聚合酶链式反应 (PCR)得到了嗜麦芽假单胞菌 (Pseudomonasmaltophilia)热休克基因dnaK启动子的DNA片段dnaKp。将dnaKp的PCR的产物亚克隆在报道载体质粒 pUCD6 15的LuxCDABE基因上游 ,成重组的具有启动子的质粒融合体pUCD6 15 p。转化到大肠杆菌的pUCD6 15 p启动子对热、有机化合物和重金属的诱导响应快速灵敏 ,表现出强的启动子功能 ,能启动LuxCDABE基因表达 ,使荧光酶活性提高。借助荧光酶活性的变化 ,可检测系统中一些有机物和重金属的存在 。 展开更多
关键词 亚克隆 热休克反应 dnak启动子 嗜麦芽假单胞菌 大肠杆菌
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热休克蛋白DnaK在大肠杆菌中的克隆与表达
11
作者 陈帅君 边靖 《天津农学院学报》 CAS 2010年第3期35-37,共3页
PCR扩增了热休克蛋白DnaK(HSP70)基因,将其连接到pBAD Directional TOPO载体上,构建了重组表达质粒,转化至One ShotTOP 10中的大肠杆菌Top 10中,经阿拉伯糖诱导获得重组蛋白。通过Western blot验证,表明该目标蛋白具有与鼠抗DnaK单... PCR扩增了热休克蛋白DnaK(HSP70)基因,将其连接到pBAD Directional TOPO载体上,构建了重组表达质粒,转化至One ShotTOP 10中的大肠杆菌Top 10中,经阿拉伯糖诱导获得重组蛋白。通过Western blot验证,表明该目标蛋白具有与鼠抗DnaK单抗特异结合的抗原活性,说明表达的重组蛋白为Hsp70,该研究为进一步探讨Hsp70的生物学功能和作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 dnak 热休克蛋白 克隆
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甘氨酸甜菜碱和分子伴侣dnaK在嗜盐四联球菌耐盐机制中的作用 被引量:3
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作者 卢良坤 罗立新 +1 位作者 黎攀 成丽丽 《中国酿造》 CAS 2013年第2期25-32,共8页
能耐高盐的嗜盐四联球菌CICC 10469是从传统的酱料中分离得到。为研究耐盐特性与相容性溶质积累和分子伴侣dnaK特性的关系,使用核磁共振来检测其主要的相容性溶质。不同盐浓度对耐盐的嗜盐四联球菌和不耐盐的乳酸乳球菌MG1363的生长的... 能耐高盐的嗜盐四联球菌CICC 10469是从传统的酱料中分离得到。为研究耐盐特性与相容性溶质积累和分子伴侣dnaK特性的关系,使用核磁共振来检测其主要的相容性溶质。不同盐浓度对耐盐的嗜盐四联球菌和不耐盐的乳酸乳球菌MG1363的生长的影响通过测量OD600来获得。盐浓度对分子伴侣dnaK表达的影响通过实时荧光定量RT-PCR来检测。相容性溶质和可溶性蛋白随盐浓度的变化通过HPLC和酶标仪来检测。结果显示嗜盐四联球菌以甘氨酸甜菜碱作为主要的相容性溶质。适合的盐浓度能够促进菌体的生长,在一定盐浓度范围内,甘氨酸甜菜碱,可溶性蛋白和分子伴侣dnaK随盐浓度的增加而升高,然而超过一定盐浓度范围后,表达量将会减少。这表明细菌能够根据外部环境做出适当的调整以维持细胞的正常生理功能。而乳酸乳球菌MG1363很少有相容性溶质和分子伴侣dnaK以耐受外部盐浓度。这表明相容性溶质和分子伴侣dnak在嗜盐四联球菌生长中起重要的作用。总之,中度嗜盐菌的主要耐盐机制是通过快速合成和释放甘氨酸甜菜碱及分子伴侣dnaK高活性表达来完成。 展开更多
关键词 嗜盐四联球菌 分子伴侣dnak 相容性溶质 核磁共振 高效液相色谱 耐盐
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布鲁氏菌DnaK基因缺失株的构建及其功能初步评价 被引量:2
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作者 张俊波 印双红 +6 位作者 易继海 张红 方维焕 王嘉福 郭飞 李志强 陈创夫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期992-997,共6页
为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏... 为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选该菌疫苗株M5-90的DnaK基因缺失株,并对获得的M5-90ΔDnaK遗传稳定性、生长曲线、毒力和细胞免疫指标进行检测。结果表明,M5-90ΔDnaK与M5-90体外生长曲线相似, M5-90ΔDnaK在胞内的存活能力显著低于M5-90 (p<0.05), M5-90和M5-90ΔDnaK诱导小鼠血清IFN-γ水平相似(p>0.05),并且均显著高于PBS组(p<0.01)。结果表明,M5-90ΔDnaK有望成为毒力低且可诱导机体细胞免疫的疫苗候选株。本研究为布鲁氏菌致病机制的研究和疫苗的研发提供科学依据。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 dnak基因 同源重组 存活能力
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dnaK操纵子研究进展 被引量:1
14
作者 戴莹 刘金凤 +1 位作者 牛雪薇 张志民 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 2015年第7期446-449,共4页
dna K操纵子在G+菌中包含grp E、dna J、hrc A等基因成员。基于16S r DNA序列的研究发现,链球菌、乳球菌、清酒乳杆菌、分支杆菌具有密切亲缘关系。本文就己发现的dan K操纵子的基因及其结构、功能和可能的作用机制作一综述。
关键词 dnak操纵子 基因 分子机制
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志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定 被引量:2
15
作者 王羽 周围 +6 位作者 廖翔 岳俊杰 宋婷 戴红梅 陈欣欣 梁龙 呼和巴特尔 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期105-109,共5页
目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯... 目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白Dna K-His。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清。用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价。结果重组质粒p ET24a-dna K在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达。用纯化的融合蛋白Dna K-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验。结论成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白的小鼠多克隆抗体。 展开更多
关键词 志贺菌 福氏5a M90T 伴侣蛋白Dna K 热休克蛋白70 多克隆抗体
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Gene cloning and sequence analysis of the cold-adapted chaperones DnaK and DnaJ from deep-sea psychrotrophic bacterium Pseudoalteromonas sp. SM9913 被引量:1
16
作者 ZHAO Dianli CHEN Xiulan HE Hailun SHI Mei ZHANG Yuzhong 《Acta Oceanologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2007年第6期91-100,共10页
Pseudoalteromonas sp. SM9913 is a phychrotmphic bacterium isolated from the deep-sea sediment. The genes encoding chaperones DnaJ and DnaK of P. sp. SM9913 were cloned by normal PCR and TAIL - PCR (GenBank accession ... Pseudoalteromonas sp. SM9913 is a phychrotmphic bacterium isolated from the deep-sea sediment. The genes encoding chaperones DnaJ and DnaK of P. sp. SM9913 were cloned by normal PCR and TAIL - PCR (GenBank accession Nos DQ640312, DQ504163 ). The chaperones DnaJ and DnaK from the strain SM9913 contain such conserved domains as those of many other bacteria, and show some cold-adapted characteristics in their structures when compared with those from psychro-, meso-and themophilic bacteria. It is indicated that chaperones DnaJ and DnaK of P. sp. SM9913 may be adapted to low temperature in deep-sea and function well in assisting folding, assembling and translocation of proteins at low temperature. This research lays a foundation for the further study on the cold-adapted mechanism of chaperones DnaJ and DnaK of cold-adapted microorganisms. 展开更多
关键词 COLD-ADAPTED chaperone DNAJ dnak DEEP-SEA Pseudoalteromonas sp. SM9913 gene cloning sequence analysis
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DnaK蛋白扭链残基突变体影响其ATPase活性的分子动力学模拟研究
17
作者 张桥石 李灌澍 +2 位作者 窦薛楷 薛友林 宋有涛 《生物信息学》 2016年第3期139-145,共7页
大肠杆菌分子伴侣蛋白Dna K氮端核苷酸结合域(NBD,nucleotide-binding domain)的II-A和II-B子域之间的一些高度保守的扭链残基突变后(I202A,S203A,G223A,L227A,G228A),其ATPase活性也发生变化原因不清楚。我们通过同源建模的方法构建NB... 大肠杆菌分子伴侣蛋白Dna K氮端核苷酸结合域(NBD,nucleotide-binding domain)的II-A和II-B子域之间的一些高度保守的扭链残基突变后(I202A,S203A,G223A,L227A,G228A),其ATPase活性也发生变化原因不清楚。我们通过同源建模的方法构建NBD与小分子ATP相互作用的各蛋白模型,使用分子动力学模拟方法研各模型的结构变化并尝试找出其与ATPase活性变化的关系。结果表明,除L227A外,所有突变模型T11烃基与ATP-γ磷酸基团间的距离与活性变化间具有明显规律;但是所有模型中,能影响与Dna J结合,从而影响ATPase活性的β220(214-221)部分的紧致性变化符合规律,进一步的蛋白对接实验证实了这一点,所以这些扭链残基突变体可能主要是通过这两个部分的变化,引起ATPase活性的改变。 展开更多
关键词 dnak 扭链残基 同源建模 分子动力学模拟 蛋白对接
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Induction of DnaK upon <i>γ</i>-Irradiation at High and Low Rates in <i>Escherichia coli</i>
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作者 Linda Saucier Claudine Dube +1 位作者 Anthony Guernec Fadia Naim 《Food and Nutrition Sciences》 2012年第10期1349-1353,共5页
DnaK is implicated in protein folding, repair and degradation. Its protective role during heat shock is well documented and many other stresses can also induce its production. Using a competitive ELISA, intracellular ... DnaK is implicated in protein folding, repair and degradation. Its protective role during heat shock is well documented and many other stresses can also induce its production. Using a competitive ELISA, intracellular DnaK concentrations were determined in Escherichia coli ATCC 25922 exposed to a γ-irradiation dose of 0.3 KGy applied either at high (8 × 10-2 KGy/min) or low rates (3 × 10-3 KGy/min) and with or without a recuperation period of 22 h at 37℃ post-treatment. All four irradiation treatments reduced cell counts similarly and significantly compared to the control (P < 0.0001). However, the highest DnaK concentration was observed in cells irradiated at low rate without recuperation (105,416 molecules/cell;P = 0.0001). Furthermore, DnaK levels remained higher than the control (38,500 molecules/ cell) after the recuperation period (P < 0.05). Variation in the intracellular DnaK concentration indicates that the bacterial stress response was modulated differently according to the irradiation treatment (P = 0.0001). 展开更多
关键词 dnak CHAPERONE Irradiation Bacterial Stress Response Efficacy of Antimicrobials
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A、B、C群链球菌DnaK蛋白的原核表达及生物信息学分析
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作者 鲍光彬 姜雅倩 +2 位作者 姚卫平 卢奇 王晴 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2023年第11期1245-1251,共7页
目的分别对来自兰氏分群A、B、C群链球菌的DnaK蛋白进行原核表达和纯化,并进行生物信息学分析。方法根据DnaK基因序列设计特异性引物,以A群链球菌化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)菌株CVCC593、B群链球菌无乳链球菌(Streptococcus ... 目的分别对来自兰氏分群A、B、C群链球菌的DnaK蛋白进行原核表达和纯化,并进行生物信息学分析。方法根据DnaK基因序列设计特异性引物,以A群链球菌化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)菌株CVCC593、B群链球菌无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌株S001和C群链球菌马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subspecies equi)菌株ATCC35246基因组为模板进行PCR扩增,用限制性内切酶BamH I和XhoⅠ双酶切pET-28a质粒和扩增得到的DnaK基因片段后连接,分别构建带His标签的重组质粒。经测序验证后,将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达重组蛋白并纯化,采用SDS-PAGE电泳和Western blot进行分析验证。利用生物信息学工具对DnaK蛋白进行分析和预测。结果成功原核表达和纯化了3株不同兰氏分群链球菌的DnaK重组蛋白,分子质量约为70 ku。蛋白呈可溶性表达,经镍柱纯化后得到单一电泳条带的目的蛋白。Western blot检测该重组蛋白能被His标签抗体和R群链球菌猪链球菌(Streptococcus suis)DnaK蛋白的兔多克隆抗体识别。生物信息学分析A、B、C群的DnaK蛋白与R群DnaK蛋白之间同源性在90%以上;亚细胞定位分析显示DnaK蛋白主要存在于细胞质中;DnaK蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,以由α-螺旋占比较高,均在40%以上;蛋白互作网络分析表明,链球菌DnaK可能与DnaJ、GrpE、HrcA等蛋白发生互作。结论原核表达并纯化了A、B、C群链球菌的DnaK蛋白,生物信息学分析显示A、B、C群链球菌DnaK蛋白与R群DnaK蛋白的同源性高,且主要存在于细胞质中,为进一步研究链球菌DnaK蛋白的功能及其在致病机制中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 链球菌 dnak蛋白 原核表达 生物信息学分析
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中国莱姆病螺旋体DnaK基因的人T细胞表位研究
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作者 张琳 侯学霞 +1 位作者 苗广青 郝琴 《热带医学杂志》 CAS 2019年第2期154-161,共8页
目的了解我国引起莱姆病的伯氏疏螺旋体重要抗原之一DnaK基因及其表位区的多样性,理解伯氏疏螺旋体与宿主之间的相互作用机制和伯氏疏螺旋体抗原分子引起的免疫应答反应。方法比对分析我国68株具有代表性的伯氏疏螺旋体菌株,包含了4个... 目的了解我国引起莱姆病的伯氏疏螺旋体重要抗原之一DnaK基因及其表位区的多样性,理解伯氏疏螺旋体与宿主之间的相互作用机制和伯氏疏螺旋体抗原分子引起的免疫应答反应。方法比对分析我国68株具有代表性的伯氏疏螺旋体菌株,包含了4个重要基因型。使用国际参考株B31(Borrelia burgdorferi sensu stricto,B.B.s.s)作为参考菌株。结果结果表明DnaK基因的T细胞抗原表位区有单核苷酸变异(SNP),但氨基酸序列与参考菌株没有差异。该基因序列90~1 838 bp的dN/dS值为0.03。同时,我国伯氏疏螺旋体主要致病基因型B.garinii的核酸变异较大。结论 DnaK基因的T抗原表位高度保守,可能是感染之后直接刺激免疫系统引起炎性反应的原因之一。此外在不改变蛋白功能的前提下,基因的多样性可能与其适应环境有关。 展开更多
关键词 伯氏疏螺旋体 dnak T抗原表位 高度保守
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