香蕉离体茎尖超低温保存研究

以香蕉（Musa spp．）试管苗为试材，对其离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存的影响因素进行了研究。小滴玻璃化法和玻璃化法超低温保存后再生率的差异表明，香蕉更适合用小滴玻璃化法进行超低温保存。香蕉小滴玻璃化法超低温保存的方案如下：试管苗在60g／L蔗糖的MS培养基上培养1—2个月，剥离带有1～2片叶原基的茎尖，室温下装载30min（可延长至4h），0℃下PVS2处理40～50min。6个基因型的14个品种的再生率平均为46．9％。通过SSR分子标记检测，再生植株的遗传稳定性没有发生改变。该结果为香蕉种质资源的长期保存提供了理论依据和技术支撑。

扁桃小滴玻璃化超低温保存研究

【目的】以扁桃休眠茎尖为试材,探讨小滴玻璃化法对扁桃离体超低温保存的影响,为扁桃种质资源的长期保存提供有效途径。【方法】采用小滴玻璃化法,通过正交设计试验和单因素试验对预培养蔗糖浓度、预培养时间、装载时间和PVS2[30%(ω,后同)甘油+15%二甲基亚砜+15%乙二醇+0.4 mol·L^(-1)蔗糖]脱水处理时间这4个因素影响扁桃休眠茎尖超低温保存后成活率的情况进行分析。【结果】预培养时间对休眠茎尖超低温保存后成活率的影响极显著(P<0.01),而预培养蔗糖浓度、装载时间和PVS2处理时间的影响不显著。建立了以‘莎车14号’为代表的扁桃茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系,最佳处理方案是:用0.5 mol·L^(-1)预培养蔗糖液处理2 d,装载液处理20 min,PVS2脱水处理120min,放入含新鲜PVS2小滴的铝箔纸上投入液氮24 h后,浸入用40℃温水预热过的洗涤液(1.2 mol·L^(-1)蔗糖的MS)中30 s,然后再将休眠茎尖转入新鲜的洗涤液中洗涤30 min。恢复后接种在MS+0.3 mg·L^(-1)6-BA+0.5 mg·L^(-1)IAA+0.3 mg·L^(-1)GA3培养基上,扁桃成活率达80.44%。运用优化的方案对‘莎车1号’‘莎车11号’和‘莎车18号’3个扁桃品种进行超低温保存,平均成活率分别为87.41%、85.44%和83.02%。【结论】利用小滴玻璃化法可提高扁桃超低温保存成活率,建立了适合扁桃休眠芽超低温保存技术方法,为扁桃种质资源的长期保存提供理论和实践借鉴。

香蕉茎尖滴冻法保存中细胞的超微结构变化

应用透射电镜研究了香蕉茎尖滴冻法超低温保存中细胞超微结构的变化规律。结果表明:装载后,细胞液泡化程度降低,出现质壁分离。脱水处理使质壁分离程度加重,原生质体浓缩,一部分细胞的细胞壁、膜系统发生了不可逆的损伤;也有小部分位于分生组织区域的细胞结构虽然发生了变化,但程度不深,在恢复培养时会自动修复,并再生出植株。细胞严重伤害主要发生在脱水处理过程中,冷冻环节基本上不产生新的损伤。讨论了上述变化的可能机制。

怀黄菊微滴玻璃化超低温保存再生植株的生理和同工酶分析

为了验证前期建立的微滴玻璃化法超低温保存技术是怀黄菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.‘Huaihuang’)种质资源保存的一种有效方法,对微滴玻璃化法超低温保存后怀黄菊再生植株叶片的膜脂过氧化相关指标及过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)同工酶进行了分析。结果表明:与常温保存植株相比,供试怀黄菊再生植株叶片的相对电导率、超氧阴离子(O2·—)和丙二醛(MDA)含量均显著降低,保护酶系统除了POD活性稍有增强外,SOD、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性均显著增强;保存后再生植株叶片中SOD和POD同工酶的条带数目没有改变,但有些谱带的亮度增强。研究结果不仅从生理水平验证了怀黄菊经微滴玻璃化超低温保存后的再生植株增强了抗膜脂过氧化的能力,而且从POD、SOD同工酶水平验证了其遗传稳定性的保持,从而说明微滴玻璃化法超低温保存技术是保存怀黄菊种质资源的理想方法。

马铃薯茎尖超低温保存流程TTC活力响应

以马铃薯栽培种呼自83-213无菌试管苗茎尖为材料,通过开展2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride)茎尖活力染色关键因素研究,优化了马铃薯茎尖TTC活力染色条件,确定了适合的染色温度为40℃,染色时间为2 h。利用优化的TTC活力染色条件,对马铃薯茎尖小滴玻璃化超低温保存关键步骤处理茎尖进行TTC活力观察。研究发现:经蔗糖预培养(MS培养液添加0.3 mol/L和0.5 mol/L蔗糖)的茎尖与新鲜茎尖均保持高活力;经PVS2处理后茎尖表现时空特异性活力丧失和存活,分生组织和叶原基中间区域仍保持较高活力。通过对茎尖TTC活力染色面积测定,发现当茎尖TTC活力染色面积比≥0.4时,TTC活力染色与恢复培养存活率呈极显著正相关。

应用茎尖滴冻法超低温保存香蕉资源研究(英文)

采用正交试验探讨了滴冻法中装载液处理时间、玻璃化溶液处理时间和过渡培养时间的最优组合：另外还研究了不同冰冻保护剂、茎尖大小、恢复培养基中大量元素浓度对滴冻法保存效果的影响。通过试验筛选出了最佳的滴冻法保存方案：剥取含有1～2个叶原基的茎尖，长约1．5～2．5mm，先在室温下用装载液预处理20～120min．再用玻璃化溶液PVS2于0℃下处理30～50min，接着将PVS2溶液滴于铝箔上，每个液滴中放一个茎尖，迅速投入液氮。保存1h后，将铝箔取出投入卸载液（Suc．1．2mol·L^-1＋MS）中快速解冻。15min后取出茎尖，用滤纸吸去水分，转入过渡培养基上（Suc 0．3mol^-1＋MS）暗培养24h。再转到恢复培养基上，暗培养1周后转移到光下常规培养。采用滴冻法成功保存了分属于5个基因组型的15份香蕉资源，每种基因组型的平均成活率为：AAA78．0％．AAB57．8％．ABB72．1％，AA43．3％，野生蕉42．2％。

江西铅山红芽芋胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存技术的研究

探索江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的小滴玻璃化法超低温保存,为其种质资源的超低温保存提供技术基础和理论依据。植物组织培养和单因子试验的方法。江西铅山红芽芋胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存的较佳程序为:约0.2 g胚性愈伤组织在25℃下转入MS+2 mg·L-1TDZ+1 mg·L-1NAA+0.5 mmol·L-1蔗糖的培养基中,于14 h·d-1光周期下预培养3 d后用MS+2 mmol·L-1甘油+0.4 mmol·L-1蔗糖在25℃下装载20min,然后用PVS2在0℃下脱水40 min,吸取5滴PVS2到铝箔条上,将脱水后的红芽芋胚性愈伤组织块转到铝箔条上的PVS2液滴里。附有胚性愈伤组织块的铝箔条在液氮里蘸一下,然后迅速将其转入2 mL装满液氮的冷冻管中,再投入液氮保存1 d。从液氮中取出冷冻管中的铝箔条,浸入用40℃温水预热过的洗涤液(MS+2 mg·L-1TDZ+1 mg·L-1NAA+1.2 mmol·L-1蔗糖)中,使胚性愈伤组织块从铝箔条上脱落下来,然后再将胚性愈伤组织块转入新鲜的洗涤液中洗涤3次,每次10 min。洗涤后转入MS+2 mg·L-1TDZ+1 mg·L-1NAA固体培养基上,先暗培养7 d再转到14 h·d-1光周期中培养。30 d后将分化出的胚状体再次转入MS+2 mg·L-1TDZ+1 mg·L-1NAA固体培养基上可再生完整植株。红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存后的平均成活率约为80%。红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗没有发生形态学、生理学和细胞学的变异。红芽芋胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存可以保证其遗传资源的稳定性,为江西铅山红芽芋种质资源的离体保存提供了一条新的途径。

应用改良滴冻法超低温保存两种柿属植物的研究

以君迁子(Diospyros lotus L.)和柿(D.kaki Thunb.)组培苗茎尖为试材,对影响超低温保存效果的主要因素,如低温锻炼方式、预培养条件、PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mo1/L蔗糖)处理时间等进行了研究。建立了2种柿属植物的超低温保存程序:(1)切取1cm左右试管苗梢段继代到1/2MS(KNO3和NH4NO3减半)培养基中,交替低温[昼(25±1)℃、夜(4±1)℃]锻炼6周;在含0.5mol/L蔗糖的1/2MS培养基上预培养5d,20℃下装载液(2.0mo1/L甘油+0.4mol/L蔗糖)过渡10min,0℃下PVS2处理1.5h;(2)投入液氮保存;(3)40℃水浴化冻,洗涤5～6次后接种于含1.0mg/LTDZ、0.6g/L可溶性PVP、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的培养基(作者在优化柿属植物离体培养体系试验中获得)上暗培养1周,转入25℃,1500lx培养室。按照上述程序培养,‘鄂柿1号’、‘湘西甜柿’和君迁子的成活率分别为79.6%、67.4%和60.9%。

黄独胚性悬浮细胞的小滴玻璃化法超低温保存

【目的】建立和优化黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存的技术体系。【方法】通过单因子试验探究各种条件对黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存效果的影响,并通过RAPD分子标记检测其冻后再生苗的遗传稳定性。【结果】黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存较佳的技术体系如下:黄独胚性悬浮细胞(25±1)℃下在MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+0.8 mol/L蔗糖的液体培养基中预培养4 d;(25±1)℃下在装载液(MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖,pH 5.8)中装载70 min;0℃下在PVS2(300 g/L甘油+150 g/L乙二醇+150 g/L二甲基亚砜+0.4 mol/L蔗糖,pH 5.8)中脱水100 min;冻后铝箔条浸入37℃恒温预热过的培养液(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖,pH 5.8)中化冻;(25±1)℃下用洗涤液(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+1.2 mol/L蔗糖,pH 5.8)进行洗涤,洗涤3次,每次洗涤时间为10 min;洗涤后先黑暗培养5 d再置于光周期下培养。黄独胚性悬浮细胞冻后相对存活率为90.5%±4.4%。液氮保存时间对黄独胚性悬浮细胞冻后存活率无显著影响。RAPD检测结果表明黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存再生植株无变异,未发现遗传稳定性发生变化。【结论】本试验建立的黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存技术程序较为可靠,可为黄独胚性悬浮细胞的长期保存提供技术参考。

小滴玻璃化法脱除蝴蝶兰种苗建兰花叶病毒的研究

以感染建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)的蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)品种‘满天红’为试材,通过筛选蔗糖预培养浓度、预培养时间、PVS2(Plant vitrification solution 2,PVS2)处理时间三个关键因素,建立蝴蝶兰茎尖小滴玻璃化超低温脱毒体系,将再生的茎尖诱导类原球茎,再分化成苗,经RT-PCR检测CymMV的脱除情况,阴性结果的再生植株进行增殖和诱导生根。结果显示:最佳预培养为:BM+0.6 mol·L-1蔗糖处理1~2 d,超低温茎尖的成活率为70%~76.7%,再生率为53.3%~56.7%;PVS2最佳处理时间为60~90 min,超低温茎尖的成活率为73.3%~76.7%,再生率为50.0%~56.7%。再生植株经RT-PCR检测,CymMV的脱除率为50%。该研究为兰科植物脱除CymMV提供了理论和技术基础。

小鼠胚胎冷冻技术的研究进展

传统胚胎冷冻技术如OPS、冷冻环、冷冻帽、冷冻膜等,在胚胎复苏率和囊胚形成率、技术可行性、温度适用范围、冰冻和解冻速率等方面各具有其特定优缺点,在实际推广和应用中存在一定局限性。本文就新型微滴式玻璃化(Modified droplet vitrification,MDV)胚胎冷冻技术和高重量渗透摩尔浓度玻璃化(High osmolality vitrification,HOV)两种新型胚胎冷冻保存技术进行概述,并阐明胚胎冷冻保存及复苏发育过程中所受温度、饮食中植物雌激素、N-乙酰半胱苷酸等参数的影响。

红掌小滴玻璃化法超低温保存研究

以红掌腋芽为试材,探讨小滴玻璃化法对红掌超低温保存的影响因素,并对再生植株进行遗传稳定性检测。结果表明,红掌腋芽置于含0.4 mmol/L蔗糖和2 mmol/L甘油的MS固体培养基中预培养4 d后,在0℃下80%PVS_(2)处理50 min,转到铝箔条上PVS_(2)液滴中,将铝箔条迅速浸入液氮中,2 s后直接转入装满液氮的冻存管中,投入液氮至少保持30 min;室温下用含有1.2 mmol/L蔗糖的MS液体培养基复温并卸载20 min后置于恢复培养基上,腋芽存活率高达63.70%。通过ISSR和SSR分子标记检测,再生植株的遗传稳定性未发生改变。该研究结果为红掌种质资源的长期保存提供有效途径。

苹果砧木离体茎尖小滴玻璃化超低温保存体系的优化

本文以苹果砧木‘54-118’组培苗为材料,采用正交试验对离体茎尖小滴玻璃化超低温保存体系进行优化。结果表明,低温锻炼和植物玻璃化保护溶液2(PVS2)处理时间是影响小滴玻璃化超低温保存后苹果砧木茎尖成活率和再生率的关键因素。优化后的苹果砧木离体茎尖小滴玻璃化超低温保存体系为:继代生长30 d的组培苗在4°C黑暗条件下低温锻炼10 d,取0.5~1.0 mm的茎尖,预培养2 d,加载液(LS)处理20min,PVS2脱水处理60 min,处理后的茎尖包裹在小液滴中,液氮冷冻保存;冷冻茎尖在卸载液(ULS)中常温处理20 min,转入茎尖再生培养基进行恢复培养,暗培养7 d后,转入正常光照条件下培养,获得再生苗。简单重复系列区间(ISSR)检测表明小滴玻璃化超低温保存未改变材料的遗传稳性。优化后的小滴玻璃化超低温保存体系成功用于其他3个苹果砧木品种的超低温保存,4个苹果砧木品种超低温保存后的平均茎尖成活率和再生率分别为74.58%和64.81%。

越橘离体腋芽小滴玻璃化超低温保存

以越橘试管苗“密斯梯”的腋芽为材料,筛选了小滴玻璃化超低温保存过程中的各项技术参数;用8种66份越橘基因型验证该方法的广谱性;用10个ISSR引物检测超低温保存后5个品种再生株系遗传稳定性。结果表明:从30 d苗龄试管苗切取长1~1.5 mm单腋芽茎段分别在继代培养基(WPM+0.3 mg/L ZT+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖,SCM)和预培养基(WPM+7 g/L琼脂+0.3 mol/L蔗糖,PCM)上各培养1 d[(25±2)℃黑暗];腋芽用加载液(WPM+2.0 mol/L甘油+1.0 mol/L蔗糖,LS)处理30 min(室温),然后浸入植物玻璃化保护溶液Ⅱ(WPM+300 g/L甘油+150 g/L乙二醇+150 g/L二甲基亚砜+0.4 mol/L蔗糖,PVS2)中40 min(0℃);在铝箔纸上制成小滴(1腋芽/小滴)之后投入液氮中保存;取出的材料立即用卸载液(WPM+1.2 mol/L蔗糖,ULS)处理20 min(室温);在SCM上腋芽黑暗培养1 d后转至正常条件下再生培养。广谱性验证结果为平均成活率81.3%和再生率47%。5个越橘品种的分子标记检测结果显示未出现特异性条带。

红豆越橘组培苗茎尖小滴玻璃化超低温保存

研究了红豆越橘组培苗茎尖的小滴玻璃化超低温保存方法。剪取苗龄30 d的组培苗带顶芽茎段,在WPM(Woody plant medium)+0.5 mg/L ZT(Zeatin玉米素)+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂培养基(SSM)上,于4℃黑暗条件下炼苗25 d;将剥取的长约2.0 mm茎尖在黑暗和(25±2)℃条件下用预培养基(WPM+0.3 mol/L蔗糖+7 g/L琼脂)培养24 h;室温下茎尖在加载液(WPM+2.0 mol/L甘油+1.0 mol/L蔗糖)中处理30 min;0℃下用植物玻璃化溶液Ⅱ(PVS2)处理茎尖40 min;0℃下在铝箔条上将茎尖与PVS2制成小滴(2.5μL),并迅速投入液氮(-196℃)中保存1 h;从液氮中取出带茎尖的铝箔条迅速转入卸载液(WPM+1.2 mol/L蔗糖)中,室温下解冻和卸载20 min;将卸载的茎尖在SSM培养基上黑暗培养(25±2)℃1 d;之后在正常光照条件下再生培养。结果表明:再生培养30 d后,试验的4份种质资源的平均再生率为76%,这为红豆越橘种质资源保存提供了一种新的途径。

巴戟天离体保存与茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系的构建

本研究以巴戟天为试验材料,探究试管苗生长的最适培养容器及离体保存的最适培养基,并以此为基础构建茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系。结果表明,组培袋中植株长势更好且延缓生长方面较玻璃瓶和塑料瓶差异不显著,可作为巴戟天离体保存培养容器。高糖低激素培养基在巴戟天离体保存方面有显著效果,试管苗的保存时间从4个月延长至6个月。以高糖低激素培养基预处理的植株茎尖经过常温玻璃法小滴玻璃化法超低温保存后再生率可达13.3%。本研究结果为巴戟天离体保存和其茎尖小玻璃化超低温保存体系的建立奠定基础。

马铃薯茎尖小滴玻璃化法超低温保存及其再生植株的遗传稳定性

以马铃薯试管苗为试材,对其茎尖小滴玻璃化法超低温保存的影响因素进行了研究,并对再生植株进行了遗传稳定性检测。结果表明,马铃薯茎尖依次在含有0.3mol·L-1和0.5mol·L-1蔗糖的液体MS培养基中预培养各1d后,在0℃下PVS2处理30min,转到铝箔条上PVS2小滴上(约15μL),将粘有茎尖的铝箔条在液氮里蘸一下,然后直接装入盛满液氮的冷冻管中,投入液氮至少保持1h。室温下用含有1.2mol·L-1蔗糖的MS液体培养基解冻并洗涤30min后,接种到MS+0.5mg·L-1Zeatin+0.1mg·L-1NAA+1.0mg·L-1GA3恢复培养基上,存活率和再生率最高达79.91%和62.52%。通过SSR分子标记检测,再生植株的遗传稳定性没有发生改变。

超低温保存植物种质资源的新途径——小滴玻璃化法

超低温保存是一种安全、有效的种质资源保存途径,可长期保存种质资源。小滴玻璃化法是在滴冻法和玻璃化法上基础上发展起来的用于植物种质资源保存的新技术。本文综述了该方法的技术概念、主要优点、基本程序、应用前景及国内外研究现状。

黄独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存及遗传稳定性研究

目的对影响黄独Dioscorea bulbifera微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存的多种因素进行探讨,并从形态学、生理学、DNA量以及光合特性参数和叶绿素荧光参数等方面对其冻后再生苗的遗传稳定性进行检测。方法采用微型块茎及其胚性愈伤组织进行诱导,小滴玻璃化法超低温保存,通过检测包括总叶绿素量、可溶性蛋白量、可溶性总糖量以及超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性等植物生理指标,并采用流式细胞术的方法对遗传稳定性进行考察。结果最佳的黄独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存条件:室温下将黄独微型块茎胚性愈伤组织块转入MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mol/L蔗糖的培养基中预培养1 d。预培养后的胚性愈伤组织块在(25±1)℃下转入装载液(MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖,p H 5.8)中处理20 min,再用100%PVS2于0℃脱水40 min。脱水后将材料转入铝箔条上的PVS2小滴中,液氮冰冻后迅速将材料转入冷冻管中(装满液氮)。投入液氮罐保持1 d后,取出铝箔条,浸入37℃洗涤液(MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+1.2 mol/L蔗糖,p H 5.8)中,胚性愈伤组织块脱落后,室温下再用新鲜洗涤液对其洗涤3次,每次10 min。洗涤后的材料接入分化培养基(MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂粉)中,暗培养2 d后转到12 h/d的光周期中培养,细胞存活率达89%以上。黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存后的再生苗与胚性愈伤组织常温再生苗在形态指标和生理指标等方面均无显著性差异(P>0.05),两者的DNA量也未发生显著变化(P>0.05)。结论建立了黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存的技术体系,其再生植株经检测无遗传变异,为薯蓣属植物种质资源的长期保存提供了理论依据和技术基础。

‘怀黄’菊微滴玻璃化超低温保存体系优化及保存后再生植株的抗冷性分析

以‘怀黄’菊(Chrysanthemum×morifolium‘Huaihuang’)为材料,进行微滴玻璃化超低温处理,优化微滴玻璃化法超低温保存中的几项关键因素,对其再生苗的遗传稳定性进行探究,并对再生苗的抗冷性进行评价。结果显示:优化预培养基、装载和脱水时间后,冻存后茎尖成活率显著提高;超低温保存后,暗培养30 d+光培养90 d可长成正常植株;使用分子标记技术(ISSR)确认再生苗未发生变异,说明该体系一定程度上保持了再生苗的遗传稳定性。再生苗抗冷性实验证明,微滴玻璃化超低温处理降低了‘怀黄’菊再生苗的活性氧自由基水平、膜脂过氧化程度,提高了保护酶的活性,从而提高了再生苗的抗冷性。