应用PCR快速鉴别番鸭和鹅细小病毒

根据已发表的番鸭和鹅细小病毒基因组全序列 ,设计并合成了 1对通用引物 (PC1/PC2 )和 1对MPV特异引物 (PS1/PS2 )。以MPV_DNA、MPV尿囊液、MPV尿囊液和GPV尿囊液混合液、GPV_DNA、GPV尿囊液和GPV细胞培养物、DHV尿囊液和H2 O为模板在同一条件下分别以 2对引物进行扩增 ,PCR产物经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果显示 :在PC1/PC2系统中 ,除DHV尿囊液和H2 O外 ,所有样品均出现长约 4 80bp的特异核酸带 ,对MPV_DNA的敏感性为 0 2pg ,对GPV_DNA的敏感性为2pg ;对MPV尿囊液的敏感性为 10 0ELD50 / 2 μl;PS1/PS2系统中 ,只有MPV_DNA、MPV尿囊液及MPV尿囊液和GPV尿囊液混合液出现预期约 110 0bp特异扩增产物 ,对MPV_DNA的敏感性为 0 2ng ,对MPV尿囊液的敏感性为 10 0 0ELD50 / 2 μl,而GPV_DNA、GPV尿囊液、GPV细胞培养物、DHV尿囊液和和空白对照均未见到条带。分别以 1ngMPV_DNA、1ngGPV_DNA、MPV尿囊液、GPV尿囊液、DHV尿囊液和空白对照样品进行扩增 ,3次重复实验结果完全一致。表明该PCR检测技术可准确、快速鉴别番鸭和鹅细小病毒 ,为临床上准确。

番鸭和鹅细小病毒PCR鉴别方法的建立

根据基因库中番鸭细小病毒 (MDPV)FM株和鹅细小病毒 (GPV)的 B株的基因序列设计了 3个引物 PVC、MDPVdn、GPVdn,分别用 MDPV-DNA、GPV-DNA、MDPV 尿囊液、GPV尿囊液、鸭瘟病毒尿囊液、传染性喉气管炎病毒尿囊液和无离子水对照 ,以 PVC/ GPVdn和 PVC/ MDPVdn特异引物在同一条件下进行PCR扩增 ,产物经 1 0 g/ L的琼脂糖凝胶电泳分析。在 PVC/ GPVdn系统中 ,MDPV-DNA、MD-PV尿囊液、DP、IL T和无离子水对照无条带 ,其余样品均出现约 460 bp的条带 ,在 PVC/ MD-PVdn系统中 ,只有 MDPV-DNA、MDPV-GPV混合 DNA、MDPV尿囊液中出现约 90 0 bp的条带 ,其余无特异性核酸带 ,对 MDPV-DNA的敏感性达 0 .5pg,对 MDPV尿囊液敏感性为 1 0 0 0EL D50 / 5μL ,对 GPV-DNA的敏感性为 0 .5pg,对 GPV尿囊液敏感性为 1 0 EL D50 / 5μL。分别将不同时间提取 0 .5ng/ μL MDPV-DNA、0 .5ng/μL GPV-DNA、MDPV尿囊液、GPV尿囊液和无离子水对照样 ,以 PVC/ GPVdn和 PVC/MDPVdn特异引物进行 PCR扩增 3次 ,结果稳定。表明该 PCR检测技术可灵敏。

番鸭细小病毒与鹅细小病毒鉴别诊断方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的同源序列区域结构基因REP以及非同源序列区域结构基因VP3,设计了2对引物,建立了一种鉴别诊断MDPV和GPV的二重PCR方法。该方法对GPV能同时扩增出220 bp和443 bp的两条片段,对MDPV只能扩增出443 bp的一条片段,对其它常见鸭病病原均无特异性扩增。应用建立的方法对36份临床病料进行检测,结果5份呈阳性,其中1份为GPV阳性,4份为MDPV阳性,病毒分离结果与病料检测结果吻合。因此,本试验所建立的鉴别诊断MDPV与GPV的PCR方法具有潜在的临床应用价值。

5株水禽细小病毒全基因组序列分析

利用PCR技术扩增鹅细小病毒(GPV)ZJ、G3和LJY毒株与番鸭细小病毒(MDPV)DK和DYL毒株全基因组。序列分析结果表明,除LJY毒株非结构基因(NS)编码626个氨基酸外,其余4株NS全长1 884bp,编码627个氨基酸;5株的结构基因(VP)全长均为2 199bp,编码732个氨基酸。GPV、MDPV NS蛋白不同毒株之间相似性分别为95.9%~99.8%和96.8%~99.0%;而GPV与MDPV NS蛋白之间相似性为88.9%~90.4%。GPV、MDPV VP蛋白不同毒株之间的相似性分别为90.2%~100.0%和96.9%~99.3%,而GPV与MDPV VP蛋白之间的相似性为79.5%~81.6%,表明GPV抗原性不同于MDPV。MDPV与GPV NS蛋白均含有4个潜在的糖基化位点;在结构蛋白区域,MDPV VP含有8个潜在的糖基化位点,而GPV为6个糖基化位点,G3与LJY毒株分别缺失582—584NTT和703—705NRT潜在的糖基化位点。5株水禽细小病毒的进化分析表明,GPV、MDPV在进化上形成两个独立的分支,各个基因片段之间未发生重组。

2018—2019年华东华南地区水禽细小病毒的进化分析

鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)严重危害水禽产业。自2015年以来,一种新型鸭源鹅细小病毒(N-GPV)在中国大陆持续爆发,给水禽产业造成重大经济损失。水禽细小病毒(WPV)病因再次引起研究人员的关注。本研究在2018—2019年期间,从中国东部和南部地区采集426份疑似细小病毒患病水禽组织样本,PCR检测总阳性率为51.2%(218/426)。最终,获得30个分离株,并对其VP3基因进行测序,进化树分析结果表明:分离株分布在7个分支,并与经典的GPV分支关系相近。本研究为水禽细小病毒(WPVs)疫苗的研发提供了候选株,仍需对水禽细小病毒进行连续不断的流行病学监测。