增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP在大肠杆菌中的表达与纯化

增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP(EGFP/V16 3A/S175G)是一种发光能力更强、更稳定的新型绿色荧光蛋白。为了获得大量高纯度的蛋白 ,将mut4EGFP基因插入原核表达载体 pTWIN1中 ,使之与几丁质结合域 (CBD) 内含肽 (intein)融合 ,获得原核表达质粒 pTWIN M 4。将 pTWIN M 4转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS ,IPTG诱导后进行SDS PAGE电泳分析 ,结果显示 ,CBD intein mut4EGFP融合蛋白在BL2 1(DE3) plysS中获得高效表达并以可溶性蛋白的形式存在。进一步采用几丁质柱纯化系统对表达产物进行纯化 ,得到了高纯度的mut4EGFP。

抗转铁蛋白受体鼠源性单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的 利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体。方法 从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA ,采用OligodT为逆转录引物 ,逆转录合成cDNA第一链 ,然后分别采用VL 和VH 框架区的PCR引物 ,扩增VH(重链可变区 )和VL(轻链可变区 )DNA片段 ,利用事先合成的存在于VL 下游引物和VH 上游引物的部分人工连接子重叠互补序列 ,将VL 和VH 的PCR回收产物进行部分重叠PCR(SOE) ,形成单链抗体基因。最后将此基因重组进表达载体pBAD gIII C中 ,经L arabinose(左旋阿拉伯糖 )诱导表达并初步鉴定。结果 构建出 70 0bp左右的单链基因 ,并获得阳性重组表达载体克隆 ,表达产物为相对分子质量 2 70 0 0左右的蛋白分子。结论 经因特网查询表明 ,单链抗体基因重链部分属于小鼠H链可变区ⅠA亚组 ;轻链属于小鼠κ轻链可变区Ⅱ亚组 ,此单链抗体基因的表达产物具有一定的特异结合活性。本研究为抗CD71单链抗体的临床应用打下了基础。

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯对雄性大鼠激素相关基因表达水平的影响

目的:探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)对雄性大鼠睾丸中激素相关基因表达水平的影响,为研究DEHP生殖毒性提供科学依据。方法:40只5周龄雄性SPF级SD大鼠,随机分为对照组(玉米油)、DEHP低剂量组(100 mg/kg)、DEHP中剂量组(500mg/kg)和DEHP高剂量组(1 5 00 m g/kg),每组10只,每天灌胃染毒1次,每周5次,连续染毒6周。于末次染毒24 h后处死动物,实时荧光定量PCR法测定睾丸组织内类固醇快速调节蛋白(StAR)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3-HSD)、17-羟基类固醇脱氢酶(17-HSD)、促性腺激素释放激素(GnRH)及雌激素受体(ERα、ERβ)的基因表达水平。结果:与对照组比较,、β基因表达水平在DEHP各剂量组均明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05);17β-HSD基因表达水平在DEHP高剂量组升高(P<0.01),而低剂量组和中剂量组则无明显改变(P>0.05);ERα基因表达在DEHP高剂量组升高(P<0.01);ERβ基因表达在DEHP低剂量组和中剂量组下降(P<0.01),但在DEHP高剂量组升高(P<0.01);GnRH基因表达水平在DEHP中剂量组和高剂量组均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论:DEHP染毒可引起雄性大鼠激素相关基因表达水平改变,干扰雄性激素的合成,可能导致生殖障碍。

谈谈时间的表示法

论述时间的表示法 ,提出不应将表示特定时间的“年、月、日、时、分、秒”看做是时间的单位 ,而应看做是时间的名称 ,“第 2天”也不能写为“第 2d”。

虾夷扇贝热休克蛋白60基因克隆及表达特性研究

旨在探讨虾夷扇贝高温应激的分子机理并为解决该种夏季死亡问题打下基础。基于HSP60的转录组序列设计特异引物,采用RACE技术成功克隆获得虾夷扇贝热休克蛋白60(My HSP60)c DNA全序列。其c DNA序列全长3 368 bp,包括68 bp的5'UTR,1 569 bp的3'UTR和1 731 bp的开放阅读框,共编码576个氨基酸。利用基因步移技术扩增My HSP60基因启动子区域序列并测序,获得My HSP60基因启动子区域序列1 236 bp,该区域包含2个TATA盒,4个CCAAT盒,3个热激元件。基于氨基酸序列构建的系统进化树与传统物种进化规律基本吻合。通过实时PCR检测发现HSP60在虾夷扇贝各组织中均有表达,升温后肾脏中该基因的转录量升高极显著,而肝胰腺、外套膜、血淋巴和闭壳肌中的转录量升高显著(P<0.05),说明该基因在热应激过程中发挥一定作用。

分离差异mRNA技术及其应用

从介绍分离差异mRNA技术的发展过程入手,重点概述了SSH、DDRT-PCR和cDNA-AFLP技术的程序和优缺点, 及其在分离目的基因、研究发育调控和杂种优势的分子机理等领域的应用。

红细胞生成素(EPO)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中稳定表达

将ＥＰＯｃＤＮＡ分别插入真核表达质粒载体ｐＳＶ２ｄｈｆｒ和ｐｃＤＮＡ３的适当位点，用电脉冲法导入ＣＨＯ细胞，用ＥＬＩＳＡ法检测ＥＰＯ的表达量，用ＴＦ１细胞检测ＥＰＯ表达产物的生物活性．结果表明，用ｐＳＶ２ｄｈｆｒ作为载体，在抗ＭＴＸ阳性细胞克隆中，获得了表达ＥＰＯ（２５８ｎｇ／ｍＬ培养液）的ＣＨＯ细胞株，并且表达产物具有生物活性．进一步的传代和冻存试验表明。