思茅松1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)基因的克隆及功能分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)是甲基–D–赤藓醇–4–磷酸(MEP)途径中的第一个酶,也是限速酶。本文根据思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis(A.Chev.)Gaussen)树皮转录组数据分析结果,获得思茅松DXS基因片段,然后根据获得的基因片段设计特异引物,运用RT-PCR和RACE技术从思茅松树皮中克隆得到完整的DXS基因(Pk DXS1)。Pk DXS1基因的c DNA全长序列2 888 bp,含有1个2 223 bp的开放阅读框(ORF),编码740个氨基酸,该基因推断的蛋白与赤松(Pinus densiflora Siebold&Zucc)DXS蛋白的相似性为99%,与欧洲云杉(Picea abies(L.)H.Karst.)DXS的相似性为97%;经氨基酸序列比对,推断思茅松DXS具有高等植物DXS酶特有的叶绿体转运肽,二磷酸硫胺结合位点和转酮醇酶结构域。半定量RT-PCR检测表明树皮的创伤促进DXS基因的表达。

中国柿果实扩展蛋白基因的cDNA克隆与序列分析

以中国柿膨大期和成熟衰老期果实cDNA为模板,参照其它植物细胞壁扩展蛋白(expans in)基因序列设计兼并引物,进行RT-PCR.得到的扩增产物与pUCm-T质粒连接,转化大肠杆菌JM 109.任意挑选阳性克隆,进行序列测定,得到2个序列不同的expans in cDNA片段,分别命名为Cdk-Exp1和Cdk-Exp2.2个片段均存在ex-p ansin基因的保守区域,即8个半胱氨酸残基和3个色氨酸残基.Cdk-Exp1和Cdk-Exp2分别由531个碱基和522个碱基组成,编码177个和174个氨基酸,二者核苷酸与氨基酸序列同源性分别高达92.635%和92.156%.中国柿果实expans in cDNA与草莓、番茄和桃果实的扩展蛋白基因在氨基酸水平上有较高的同源性.

香蕉果皮2个HSP70基因片段的克隆及其在热激和冷藏过程中的表达

温度逆境胁迫可以诱导热激蛋白的表达,而热激处理能够减轻果实冷害。为了探讨温度逆境对香蕉热激蛋白基因表达的调控、辨析香蕉热激蛋白基因的表达与果实冷害的关系,采用同源序列法分离了香蕉果皮HSP70基因序列-根据已经报道的HSP70基因的氨基酸保守序列设计引物、以香蕉果皮总RNA为模板,用RT-PCR方法克隆香蕉的HSP70 cDNA,Northern杂交分析该基因在不同贮藏温度下的表达特征。结果得到2个序列不同的HSP70基因片段,分别命名为Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2,Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2之间的碱基同源性为86.9%,氨基酸同源性为97.1%。Northern杂交的结果表明,38℃短期热激处理诱导了Ma-HSP70-2基因的表达,低温冷藏能使2个基因的表达增强。并初步认为Ma-HSP70可能与香蕉果实耐冷性有关。

鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法对其基因组分10个片段进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中进行测序。经BsaⅠ限制性内切酶酶切后,采用优化的连接策略将各DNA片段进行连接,获取H120株的基因组全长cDNA,其5′端具有完整的T7RNA聚合酶启动子的核心序列,3′端具有polyA尾巴结构。通过T7RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,转染BHK-21细胞并进行病毒拯救。采用RT-PCR、测序及鸡胚传代对拯救出的病毒株进行鉴定。结果表明成功地从H120株的基因组全长cDNA拯救出病毒H120-R株,为进一步开展该病毒的分子致病机理研究、新型疫苗的研制等奠定了基础。

紫杉醇合成途径中紫杉烯合成酶cDNA的克隆

【目的】研究紫杉烯合成酶超表达对紫杉醇代谢的影响,以提高红豆杉属植物细胞中紫杉醇的含量。【方法】从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)愈伤组织提取总RNA,根据已发表的中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA序列设计两对引物,通过RT-PCR技术扩增出该酶5′端长度为1 201 bp和3′端长度为1 388 bp的两个cDNA片段,将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E.coli DH5α中,5′端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定,3′端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定。两片段与双元载体pCAMBIA1300-35S::GUS以T4 DNA连接酶连接并转化到E.coli DH5α中,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。【结果】测序结果证实确为紫杉烯合成酶基因,酶切结果证实紫杉烯合成酶cDNA全长连接成功并插入到pCAMBIA130035S::GUS中。【结论】两cDNA片段拼接得到全长2 589 bp的紫杉烯合成酶基因,编码862个氨基酸,与中国红豆杉紫杉烯合成酶基因具有98%的同源性;成功构建了pCAMBIA130035S-TS载体,为下一步的转基因工作做好了准备。

柳蚕卵黄原蛋白cDNA的克隆及序列分析

经RT-PCR和RACE合成了柳蚕卵黄原蛋白(Vg)cDNA,经序列分析其长度为5701个碱基,由一个ORF组成,编码了1 774个氨基酸。氨基酸序列中有2个保守的多聚丝氨酸区域。并推测氨基酸序列中有8个天冬酰胺连接的糖基化位点(N-linked glycosylation sites)。与樟蚕、天蚕、柞蚕、野桑蚕、家蚕、樗蚕、蓖麻蚕的VgcDNA序列比对后发现有很高的同源性,分别为83.1%、81.1%、81.0%、64.7%、64.6%、79.7%、79.2%,同其它昆虫Vg cDNA序列也具有很高的同源性。根据7种蚕(家蚕、天蚕、柞蚕、蓖麻蚕、樟蚕、野桑蚕、樗蚕)VgcDNA序列建立了系统发生树。

腹水综合征肉鸡肺脏缺氧诱导因子-1α基因克隆及表达研究

从21日龄患腹水综合征(AS)鸡肺脏中提取RNA,根据健康鸡胚心室肌细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因序列(登录号为NM204297)设计引物,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收后与载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序。结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为1 576 bp。序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与鸡胚HIF-1αcDNA和氨基酸序列同源性分别为99%和98%。采用RT-PCR技术检测4只21日龄正常肉鸡和4只21日龄AS患鸡肺脏HIF-1αmRNA,结果表明,AS患鸡肺脏HIF-1αmRNA表达丰度极显著高于正常肉鸡(P<0.01)。本试验证明,HIF-1α与肉鸡肺动脉高压导致的腹水综合征相关。

禽类多瘤病毒APV-1的cDNA病毒突变体构建

为进一步研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译调控的分子机制,设计和构建了与野生型病毒APV-1相同的在AUG位点有agno-1a突变区和7个插入氨基酸的新型重组病毒.用碱裂解法提取了APV-1 cDNA克隆pHL1003,全长线性目的片段由Acc I部分酶切后回收,再用T4连接酶将合成的agno插入片段磷酸化后与目的片段连接得到了重组质粒,最后转化至E.coli DH10b感受态细胞中筛选阳性克隆.经PCR,PAGE和DNA测序验证获得了APV-1突变cDNA克隆.

鹿茸顶端组织IGF1R基因的部分cDNA克隆及差异表达

为了研究梅花鹿鹿茸顶端组织IGF1R基因的表达水平,采用TRIzoL试剂分别提取鹿茸真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层总RNA,以逆转录酶AMV反转录合成cDNA,根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGF1R基因特异引物并克隆IGF1R基因,最后利用相对荧光定量Real-time PCR法检测IGF1R基因在鹿茸顶端不同部位组织的表达差异。研究结果表明:试验成功克隆到1 203 bp的IGF1R基因序列,该序列包含IGF1R基因的部分编码序列,并编码401个氨基酸长度的多肽;与GenBank中的牛、猪、人和小鼠IGF1R基因进行比对分析,梅花鹿IGF1R基因与牛、猪、人和小鼠IGF1R核苷酸同源性分别为98%、94%、93%和88%;IGF1R蛋白氨基酸序列同源性分别为98.3%、98.5%、97.8%和94.5%。对荧光定量PCR的差异分析发现,IGF1R基因在鹿茸顶端间充质层、真皮层、前软骨层和软骨层存在明显的上调表达现象。

半滑舌鳎孕酮受体膜组分1基因的克隆及组织和时空表达规律

运用同源克隆和RACE方法获得了半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）孕酮受体膜组分I（PGRMCl）的cDNA全长序列，生物信息学分析显示，半滑舌鳎PGRMC1 cDNA序列全长1335bp，开放阅读框长546bp；其编码的蛋白是单次跨膜蛋白，在N端13～35位氨基酸残基处有一个跨膜区域。半滑舌鳎PGRMC1氨基酸序列与青鳝（Oryzias latipes）相似性最高，达到了82．9％；与青斑河纯（Tetraodon nigroviridis）相似度为81．2％。系统进化分析表明，半滑舌鳎PGRMC1与鲔形目和纯形目鱼类PGRMC1聚为一个分支。采用实时荧光定量RT-PCR技术研究发现，性成熟雌性半滑舌鳎PGRMC1 mRNA在各组织广泛表达，其中在卵巢组织中相对表达量最高（P〈0．05）。在不同卵巢发育时期，半滑舌鳎PGRMC1 mRNA在脑、垂体和卵巢中的周期表达变化特征显示：脑中PGRMC1 mRNA在卵巢Ⅲ期表达量升高明显，Ⅴ期表达水平最高（P〈0．05）；垂体中PGRMC1mRNA表达量在卵巢发育V期达峰值（P〈0．05）；在卵巢中，PGRMC1mRNA表达水平从卵巢发育Ⅱ到Ⅴ期稳步上升，Ⅴ期时达到最高值（P〈0．05）。综上，半滑舌鳎PGRMC1基因主要参与卵巢的发育和成熟过程，并在繁殖期介导孕酮调控卵母细胞的最终成熟，研究结果为半滑舌鳎繁殖内分泌调控研究提供了基础资料。

河北毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

植物巯基蛋白酶抑制剂（eysteine proteinase inhibitor,CPI）在林木的抗虫基因工程中发挥着越来越重要的作用，分离和克隆植物CPI基因进而研究该基因的功能是CPI基因工程研究的热点。本文应用PCR技术从我国乡土抗天牛树种河北毛白杨形成层中分离和克隆到了一个710bp大小的eDNA片段，同时对序列进行测定和分析。测序和分析结果表明，该eDNA片段含有一个429bp的完整开放阅读框，其编码143个氨基酸残基，具有LARFAVDEHN、QXVXG和YEAKVWVKPW三个典型的植物巯基蛋白酶抑制剂基因家族的高保守区段，同时在GenBank中进行了注册，核苷酸注册号为DQ020096，氨基酸注册号为AAY41807。氨基酸序列同源性分析表明，该基因与其他林木中的巯基蛋白酶抑制剂的同源性差异较大，同源性在48％-97％之间，其中与欧洲山杨的同源性最高，达到97％，与猕猴桃的同源性最低为48％。说明河北毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达，这为进一步研究该基因的抗虫功能奠定了良好的基础。

欧洲型PRRSV弱毒株全长基因组cDNA克隆的构建与分析

为了获得欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,通过RT-PCR技术扩增了AMERVAC-PRRS/A3弱毒株的全基因组,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择合适的酶切位点将各个亚克隆产物逐段克隆入改造过的pBluescriptⅡKS(+)载体中,从而获得了病毒的全长基因组cDNA克隆。测序结果表明,该弱毒株基因组序列全长为15 098 bp(不包括poly(A)尾)。同源性比较结果显示,Ningbo42株ORF7基因(EF473137)、FJ0603株Nsp2基因(EF592535)与该弱毒株的相应基因之间的同源性分别为100%和98%。这些数据暗示,国内欧洲型PRRSV Ningbo42株和FJ0603株的存在与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3密切相关。测序及酶切鉴定结果表明,欧洲型PRRSV全长基因组cDNA克隆已构建成功。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建

目的确定"猪高热综合征"的主要病原是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),为探寻高致病性病毒基因组结构和功能、高致病性蓝耳病发病机制,以及进一步研制针对后者的基因工程疫苗奠定基础。方法根据PRRSV基因组序列设计特异性引物,分5段扩增了高致病性PRRSV JX143株的全长cDNA,将各cDNA片段克隆到pBlueScriptⅡSK(+)载体中,进而利用重叠区中的单酶切位点将其连接成JX143株的全长cDNA克隆pJX143和含有遗传标记MluⅠ限制性内切酶的基因组全长cDNA克隆pJX143-M。结果全长cDNA克隆经体外合成RNA后转染MA-104细胞,均获得稳定的拯救病毒。通过比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线和利用拯救病毒vJX143进行动物回归试验,结果发现病毒学及生物学特性没有显著差异。结论PRRSV的JX143株病毒确实是引起"猪高热综合征"的主要病原;建立了首个高致病性PRRSV的感染性cDNA克隆,证明拯救病毒与亲本病毒生物学特性相同。

丹参钙调蛋白cDNA的克隆及其反义表达载体的构建(英文)

丹参是著名的传统中药,对心血管疾病和癌症有广泛的疗效。钙调蛋白是细胞信号转导途径中的重要蛋白,在各种生理活动中起着重要的作用,其序列比较保守。国内外对中药丹参的分子学研究很少,本文利用分子生物学手段克隆了丹参钙调蛋白基因。从丹参成熟叶片中提取总RNA,cDNA第一链经反转录合成,利用设计的引物,PCR扩增,得到丹参钙调蛋白基因,测定其全序列。在GeneBank进行了注册。其次构建了丹参钙调蛋白基因反义表达载体,以后可进行基因敲除。通过Southern杂交,进行拷贝数推测,丹参钙调蛋白cDNA至少为2个拷贝。序列分析结果表明:得到的丹参钙调蛋白基因具有完整地读码框,由454个核苷酸组成,编码150个氨基酸。与别的植物钙调蛋白基因相比有很高的同源性,核苷酸序列同源性在80%以上,编码的氨基酸序列同源性在80%以上。以上结果能使我们更加深入地研究和了解钙调蛋白。

日本曲霉β-呋喃果糖苷酶基因克隆及在酿酒酵母中的表达

通过反转录PCR法成功地扩增出日本曲霉β-呋喃果糖苷酶基因,基因片断长度为1 917bp,编码638个氨基酸。将所得片断定向克隆到pYX212载体上,并转化至酿酒酵母中,通过酵母菌落PCR检验后,确定该基因在酿酒酵母中获得表达,转化子平均酶活为26.4 U/mg。

昆明鼠乙酰胆碱酯酶基因克隆与表达

乙酰胆碱酯酶(AChE)作为有机磷和氨基甲酸酯类农药的最适反应底物,在农药残留的快速检测中得到广泛应用,本实验根据家鼠AChE全基因序列设计并合成一对特异性引物,对昆明鼠脑组织AchE进行RT-PCR扩增,扩增产物经T-载体克隆、酶切鉴定和测序分析,结果表明:昆明鼠AChE编码序列长1 845 bp.经BLAST比对发现该序列与已报道序列(No.BC046327)的同源性为99.78%.构建原核重组表达质粒pET-AChE,并在E.coli中得到高效表达,表达蛋白的分子量约为68 000.运用改进的Ellman法成功检测到重组表达蛋白的活性.

甘蔗果糖-1,6-二磷酸酯酶的cDNA片段克隆及序列分析

植物生长发育所需要的光合产物大部分以蔗糖的形式供应和运输,其中果糖-1,6-二磷酸酯酶(fructose-1,6-bisphosphatase,FBPase)水解果糖-1,6-二磷酸(FBP)形成F6P和无机磷。根据GenBank登录的甘蔗细胞质型FBPase基因(GenBank登录号x89006)的序列设计引物,从甘蔗叶片cDNA文库和茎中扩增出FBPase基因的cDNA片段sfbp1和sfbp2,并构建到pMD18-T载体进行序列测定和分析。结果表明,sfbp1和sfbp2长均是1180bp,包含完整的开放读码框,编码332个氨基酸。sfbp1核苷酸序列及其推演的氨基酸序列与甘蔗FBPase基因进行序列比对,相似性均是99%。采用DNAMAN比对分析sfbp1和sfbp2的cDNA序列及其推演的氨基酸序列,结果表明,相似性分别是99.93%和99.7%。采用ExPASy软件预测推演的sfbp1的分子量大小为36.074kD,理论等电点为5.83。

藏羚羊血红素氧合酶-1基因编码区的克隆及序列分析

目的:克隆藏羚羊血红素氧合酶-1基因编码区,并进行序列分析。方法:从藏羚羊肝组织中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出血红素氧合酶-1(HO-1)基因编码区cDNA片段,与载体连接构建重组质粒,经转化、扩增培养、鉴定后测序,测序结果利用生物信息学的方法进行分析。结果:藏羚羊HO-1基因编码区长度为897,编码298个氨基酸(GenBank登录号为:JQ809687);序列分析表明,藏羚羊HO-1基因的编码区序列与脊椎动物山羊和牛的相似性分别达到98%和96%,氨基酸序列相似性分别达到92%和97%,与其它脊椎动物HO-1基因的核苷酸及氨基酸序列相似性达到86%和87%以上,显示出高度保守性。构建的基于氨基酸序列的分子系统进化树聚类结果表明,藏羚羊与山羊的进化距离最近。结论:本研究成功地克隆出藏羚羊HO-1基因编码区序列,为从低氧细胞保护角度探讨青藏高原土著物种适应高原的分子生物学机制研究提供实验依据。

海南原鸡CD14 cDNA的克隆及其生物信息学分析

从海南原鸡外周血白细胞中提取总RNA,以总RNA为模板,利用RT-PCR技术,成功获得海南原鸡CD14全长cDNA,并对其进行较系统的生物信息学分析,内容包括序列特征分析、同源性分析、编码蛋白质理化性质及结构预测。结果表明:海南原鸡CD14的CDS序列长度为1398 bp,编码465个氨基酸,该基因编码的蛋白质相对分子质量约为4.971 ku,理论等电点为6.41。对编码蛋白的分子结构预测发现,该蛋白为跨膜蛋白,其二级结构中,α-螺旋占47.31%,β-折叠占6.88%,无规则卷曲占45.81%。比对分析表明,海南原鸡CD14基因的核酸序列与人、小鼠、牛、猕猴的同源性均在30%～38%之间。

黑麦中与耐盐性相关的cDNA片段的克隆与序列分析

SI800(Salt Induced 800 bp,SI800)为我们用mRNA差别显示技术在盐胁迫的黑麦幼苗叶片中分离到的一个盐胁迫应答cDNA片段。利用低熔点琼脂糖凝胶电泳方法纯化了该片段,并将其连接到pGEM—T easy vector上转化大肠杆菌JM 109,获得30个阳性克隆子,经过酶切和PCR双重鉴定后,选取2个阳性克隆子进行了测序,结果表明,SI800长735 bp,GenBank B last结果显示,该片段与细菌中的阿卓糖酸氧化还原酶基因的部分区段有较高的同源性。