芥菜cDNA-AFLP反应体系的优化

选用红叶芥和青叶大头菜为试材,对cDNA-AFLP反应体系中的几个关键影响因素进行优化,建立了适合于芥菜的cDNA-AFLP反应体系.结果表明:在20μL PCR反应体系中,预扩增产物稀释30倍,Mg2+浓度1.2mmol/L,dNTP浓度0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶加入0.8 U时,选扩的效果最佳.

黄瓜叶片DNA的提取及AFLP分析体系的建立

以黄瓜叶片为研究材料提取基因组DNA并进行了AFLP扩增。对影响AFLP分析体系的关键因素进行了比较和优化,探索出适宜黄瓜的DNA提取方法,并建立了AFLP分析体系,得到了较为清晰可辨的AFLP指纹图谱,为进行黄瓜的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位等研究奠定基础。

高温胁迫下番茄叶片差异表达基因的cDNA-AFLP分析

为鉴定番茄高温胁迫响应基因,应用cDNA-AFLP技术,以番茄耐热品系Saladette幼苗为研究对象,对高温胁迫早期叶片基因表达进行了mRNA指纹分析。通过768对引物组合的筛选,共分离得到187个差异表达的转录衍生片段(TDF),其中增强表达或高温胁迫下特异性表达TDF153条,抑制表达34条。对其中47个TDF进行了克隆、测序和序列分析。结果表明:34个TDF与NCBI或TIGR已有序列同源(E-Value<10-5),功能涉及信号传导、转录调控以及逆境诱导蛋白等,另有13个TDF无同源序列或同源性低,预测是一些未知功能基因。

cDNA-AFLP技术在植物抗逆性相关基因表达研究中的应用

cDNA-AFLP技术是以mRNA反转录的cDNA为模板进行AFLP分析,在保留AFLP多态性丰富、稳定性高、无需了解序列信息等优点的同时,集中显示了基因组表达序列的多态性差异,可对生物体转录组进行全面、系统的分析,并已成功地用于基因差异显示、表达基因遗传连锁作图和基因克隆等方面。文章综述了cDNA-AFLP在植物抗逆性相关基因表达特性分析及基因分离方面的应用。

水稻叶片cDNA-AFLP技术体系的建立和优化

以高温和常温处理的水稻幼苗叶片为材料,对影响cDNA-AFLP分析体系的关键因素进行了分析,建立了适宜水稻的cDNA-AFLP分析体系,并得到了清晰可辨的cDNA-AFLP指纹图谱。结果表明:离心柱式试剂盒提取的RNA较完整,纯度较高;双链逆转录试剂盒形成的cDNA经EcoRⅠ(37℃,2 h)和MseⅠ(65℃,2 h)完全酶切后,4℃连接过夜;20μL的体系中,连接产物稀释10倍液5.0μL作为预扩增的模板,并且预扩增反应的循环数为35,预扩增产物稀释20倍作为选择性扩增的模板,扩增结果较佳;6%PAGE分离快速银染法显示,64对选择性扩增引物中筛选出多态生条带丰富的AFLP引物50对。本研究为利用cDNA-AFLP分析水稻抗高温基因进行深入的研究奠定了基础。

玉米双低频酶cDNA-AFLP体系的建立

以玉米自交系QCL1094为材料,用RNAisoReagent、柱式试剂盒法、异硫氰酸胍法等3种方法提取苗期叶片总RNA,用PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit反转录获得第一链cDNA,用RNaseH、E.coliDNA聚合酶I和E.coliDNA连接酶合成第二链cDNA,用T4DNA聚合酶进行末端平滑得到双链cDNA,最后,用双低频酶EcoRI和PstI酶切双链cDNA,用T4DNA连接酶连接接头,用引物EA00和P00进行预扩增,用引物EA01和P01进行选择性扩增。经1%琼脂糖凝胶和6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明,RNA提取及cDNA-AFLP预扩增和选择性扩增的效果良好。

水稻叶片cDNA-AFLP选择性扩增反应体系的优化

在水稻Oryza sativa叶片响应稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis取食后的cDNA-AFLP试验中,对25μL体系中预扩增和选择性扩增的引物浓度、dNTP浓度、镁离子浓度及TaqDNA聚合酶用量4种反应条件影响因子进行不同梯度的优化研究。结果表明,PCR选择性扩增反应时,总反应液25μL体系中引物浓度为0.2μmol/L、dNTP浓度为0.2mmol/L、镁离子浓度为2.0mmol/L、TaqDNA聚合酶用量为13.336n kat/25μL时,可得到更多鲜明可辨的TDFs。

基于mRNA水平的差异表达基因筛选技术

随着分子生物学技术的深入发展,基因组研究重点已经由基因组测序转向基因功能鉴定,即由结构基因组学向功能基因组学转变。研究获得不同处理下基因的差异表达谱是功能基因组学的重要一环,目前已经有多种检测基因差异表达的技术可供选用。在减法杂交技术和PCR基础上发展起来的DDRT-PCR、cDNA-RDA、cDNA-AFLP和SSH技术因其实用性而得到广泛的应用,并取得了令人满意的结果。

胞质雄性不育白菜叶绿体ndhJ-trnF区域序列发生变异

以来自Polima胞质甘蓝型油菜雄性不育源转育获得的不育白菜'Bpol97-05A'和其回交亲本即保持系'Bajh97-01B'为材料,利用cDNA扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP)技术获得一条长约330bp的特异片段P1708,RT-PCR验证确认该序列为不育白菜材料所特有,经测序和BLAST比对,发现该片段除54bp的插入序列外,其余部分与大白菜和甘蓝叶绿体ndhJ-trnF基因之间的一段序列完全一致.根据基因区域两端的保守部位设计引物,以Polima不育白菜DNA和可育甘蓝型油菜的DNA为模板,分别获得了长约1900bp的序列,比较序列发现:不育白菜与可育白菜、甘蓝型油菜的DNA序列存在一定差异,'Bpol97-05A'中除多个位点发生变异外,另有108bp的插入序列,该插入由2个长度为54bp的重复序列组成,重复序列中除5′端3个碱基CTT外,其余部分均与trnF基因3′端51bp完全相同.