替格瑞洛通过akt/AMPK/eNOS信号通路调节AMI后小鼠血管新生及其机制研究

目的 探究替格瑞洛通过akt/AMPK/eNOS通路调节腺苷浓度,进而促进急性心肌梗死(AMI)后血管新生的作用,并探讨其潜在机制。方法 采用冠脉结扎法建立AMI的小鼠模型,使用替格瑞洛灌胃处理建立实验组,通过akt抑制剂Perifosine、AMPK抑制剂Dorsomorphin和腺苷受体抑制剂MRS1523建立对应蛋白抑制的模型,采用HE染色、Masson染色评估心肌损害情况,采用免疫组化、rt-PCR、Western blot检测VEGF蛋白水平和mRNA水平表达情况,采用酶标法检测AMI小鼠体内腺苷表达情况,随后采用Western blot检测akt/AMPK/eNOS通路蛋白及其磷酸化形式的表达情况。结果 替格瑞洛可明显上调p-akt/akt和p-eNOS/eNOS比值,下降p-AMPK/AMPK比值,并增加AMI后小鼠体内腺苷水平,进而促进心肌梗死后局部心肌细胞内VEGF蛋白水平和mRNA水平表达。结论 替格瑞洛可通过活化akt/AMPK/eNOS系统来调节AMI后小鼠体内腺苷浓度,进而促进局部心肌细胞内VEGF蛋白水平和mRNA水平表达。

淫羊藿苷基于PLCγ1/AKT/eNOS/NO信号通路改善大鼠少弱精症

目的:探究淫羊藿苷对少弱精症的治疗作用及其作用机制。方法:以奥硝唑(800 mg/kg)所致少弱精症大鼠为动物模型,以淫羊藿苷(50、100 mg/kg)及左卡尼汀(100 mg/kg)干预。称量生殖器官质量,统计实验产仔率,分析附睾精子密度和精子活力;ELISA试剂盒检测血清睾酮含量;苏木精-伊红(HE)观察各组大鼠睾丸组织病理学;免疫荧光染色检测生精小管Sertoli细胞数量;试剂盒测定血清NO含量;Western Blot检测睾丸p-PLCγ1、p-AKT、p-eNOS表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠睾丸指数、附睾指数、产仔率、附睾精子密度、附睾精子活力、血清睾酮含量、睾丸组织NO含量、生精小管直径及Sertoli细胞数量和睾丸组织PLCγ1、AKT、eNOS蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷100 mg/kg组大鼠睾丸指数、附睾指数、产仔率、附睾精子密度、附睾精子活力、血清睾酮含量、睾丸组织NO含量、生精小管直径及Sertoli细胞数量和睾丸组织PLCγ1、AKT、eNOS蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01)。结论:淫羊藿苷可以改善少弱精症,其机制可能与PLCγ1/AKT/eNOS/NO通路有关。

BET溴域抑制通过阻断VEGFR2介导的PAK1和eNOS激活抑制糖尿病大鼠视网膜病变机制

目的探究BET溴域抑制通过阻断血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)介导的p21激活激酶1(PAK1)和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)激活抑制糖尿病大鼠视网膜病变机制。方法选择36只雄性SD大鼠,随机选取10只大鼠作为对照组,余下大鼠采用单次注射链脲霉素60 mg/kg建立糖尿病模型。将建模成功的20只大鼠随机分为模型组和BET抑制组,每组10只。对照组大鼠不建模。BET抑制组大鼠建模后,腹腔注射80 mg·kg^(-1)·d^(-1)剂量的JQ1。使用ZEISS数码显微镜和免疫组织化学分析大鼠视网膜心血管生成。通过蛋白质印迹法分析视网膜屏障功能相关蛋白的表达。通过FITC-葡聚糖泄漏实验检测大鼠内外视网膜屏障完整性。通过RT-qPCR分析大鼠视网膜炎症因子的表达。通过酶联免疫吸附试验试剂盒检测大鼠房水VEGF浓度。通过蛋白质印迹法分析视网膜VEGFR2/PAK1/eNOS的蛋白表达。结果与对照组相比,模型组和BET抑制组视网膜新血管生成量、CD34表达、albumin蛋白表达、内外视网膜FITC-葡聚糖泄漏量、IL-1β、iNOS和ICAM-1 mRNA表达、VEGF浓度、视网膜P-PAK1、P-VEGFR2和eNOS蛋白表达均升高,ZO-1和occludin蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,BET抑制组视网膜新血管生成量、CD34表达、albumin表达、内外视网膜FITC-葡聚糖泄漏量、IL-1β、iNOS和ICAM-1mRNA表达、VEGF浓度、P-PAK1、P-VEGFR2和eNOS蛋白表达均降低,ZO-1和occludin蛋白表达均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论BET溴化域通过调节VEGFR2介导的PAK1和eNOS信号通路激活抑制血管生成,降低血管通透性,改善糖尿病大鼠视网膜病变。抑制BET溴化域的策略可能为限制血管生成相关疾病提供一种新的治疗方法。

瓜蒌皮水提物通过PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制缺血缺氧大鼠原代心肌细胞的凋亡

以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路、抑制心肌细胞凋亡为切入点,探究瓜蒌皮水提物(TP-W)保护心肌缺血的机制.分离大鼠心肌细胞,通过缺氧气体+无血清培养液培养制造缺血缺氧损伤模型,以模拟急性心肌缺血时的体内心肌细胞环境;同时添加PI3K特异性抑制剂(LY294002)和TP-W处理细胞,利用倒置相差显微镜观察细胞形态,噻唑兰法、末端标记法分别检测细胞存活率及凋亡率,免疫荧光联合免疫印迹方法定位、定量地检测细胞内PI3K、Akt及eNOS蛋白表达及磷酸化水平.结果显示:对上述缺血缺氧损伤的心肌细胞,TP-W可显著改善其生长状态、提高存活率、降低凋亡率;同时显著上调上述3种蛋白表达水平及磷酸化水平,但磷酸化水平均可被LY294002处理显著削弱.可见,激活PI3K/Akt/eNOS信号通路、抑制心肌细胞凋亡可能是TP-W抗心肌缺血的重要机制,也是中药“开胸除痹”的关键生物学内涵.

瓜蒌薤白半夏汤通过调整氧化应激激活PI3K/Akt/eNOS通路发挥对Ⅱ型糖尿病合并急性心肌缺血的保护作用

以调整氧化应激状态、激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路为切入点,探讨瓜蒌薤白半夏汤(GXBD)保护Ⅱ型糖尿病合并急性心肌缺血(T2DM-AMI)的作用机制.将36只大鼠随机分为对照组(Ctrl组)、模型组(T2DM-AMI组)、处理组(GXBD组),每组12只.对T2DM-AMI组、GXBD组联合使用灌服高脂乳剂、腹腔注射链脲佐菌素、冠脉结扎3种方法制造T2DM-AMI大鼠模型.四唑红染色检测心肌梗死率,苏木精-伊红染色检测其病理损伤情况;酶联免疫吸附法检测血浆氧化损伤成分氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、晚期糖基化终产物(AGEs)、黄嘌呤氧化酶(XO)、髓过氧化物酶(MPO),血浆抗氧化成分一氧化氮(NO)、硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的水平或活性,以及总活性氧(T-ROS)的水平和总抗氧化能力(T-AOC);蛋白免疫印迹法检测心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的表达及磷酸化水平,实时荧光定量PCR检测其中Pi3k、Akt和eNos基因的mRNA表达水平.结果显示T2DM-AMI大鼠心肌梗死严重,血浆中上述4种氧化损伤成分的水平或活性及T-ROS水平显著升高,3种抗氧化成分的水平或活性及T-AOC显著降低,心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的表达及磷酸化水平显著下调,相应基因的mRNA表达水平同样显著下降,而GXBD干预可显著逆转这些病理性变化.综上,GXBD可能通过提高抗氧化能力、清除自由基、纠正异常的氧化应激状态、激活心肌组织中PI3K/Akt/eNOS信号通路,发挥对T2DM-AMI的保护作用.

益景汤经PI3K/AKT/eNOS信号通路拮抗高糖诱导的视网膜血管内皮细胞损伤

目的探讨益景汤对高糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞损伤的拮抗作用及机制。方法将大鼠视网膜微血管内皮细胞随机分为5组:对照组(CG)、高糖组(HG)、低浓度益景汤组(LYG)、中浓度益景汤组(MYG)、高浓度益景汤组(HYG)。细胞生长至80%~90%时,往高糖组及益景汤组培养基中加入33 mmol/L葡萄糖培养3 d造高糖内皮细胞损伤模型,第4天按分组加入相应正常糖培养基及各浓度益景汤培养24 h。使用CCK-8试剂盒检测内皮细胞活性,Transwell法观察内皮细胞迁移,荧光聚合酶链式反应(PCR)检测细胞间紧密连接蛋白ZO-1及内皮细胞磷脂酰肌醇三羟基激酶(PI3K)、苏氨酸蛋白激酶(AKT)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的信使RNA(mRNA)表达。结果高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞活性降低,与对照组比较,差异有统计学意义(均P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞活性均高于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞迁移增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞迁移均低于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞间连接蛋白ZO-1及内皮细胞PI3K、AKT、eNOS的mRNA表达量均降低,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞间连接蛋白ZO-1及内皮细胞PI3K、AKT、eNOS的mRNA表达量均高于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论益景汤能经PI3K/AKT/eNOS信号通路抑制高糖诱导视网膜微血管内皮细胞迁移,提高细胞活性,减轻细胞损伤。

蛇床子素对大鼠信号通路AKT/eNOS/sGC/PKG及成骨细胞成熟分化的影响

目的研究蛇床子素(osthol)是否通过激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)/内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)/可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)/蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)信号通路促进大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROBs)矿化成熟。方法检测蛇床子素处理ROBs后,成骨性转录因子RUNX2、OSX以及AKT/eNOS/sGC/PKG信号途径蛋白表达水平、免疫荧光法观察信号通路下游蛋白核易位;检测碱性磷酸酶(alkline phosphatase,ALP)活性;用AKT特异性抑制剂MK-2206阻断AKT功能后,检测MK-2206对AKT/eNOS/sGC/PKG信号途径活性及对ROBs矿化成熟的影响,进一步评估蛇床子素促进成骨细胞矿化成熟的潜在机制。结果蛇床子素处理ROBs后,成骨性转录因子RUNX2、OSX蛋白及AKT/eNOS/sGC/PKG信号通路蛋白表达量均增加,ALP活性上升;加入AKT抑制剂后,蛇床子素不再激活AKT/eNOS/sGC/PKG信号通路,阻断了蛇床子素促进ROBs的矿化成熟。结论蛇床子素可通过激活AKT/eNOS/sGC/PKG信号通路促进成骨细胞矿化成熟。

基于VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路探讨木犀草素干预A型流感病毒的作用机制

目的探讨木犀草素对A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染的小鼠肺上皮细胞损伤模型的作用机制。方法将小鼠肺上皮MLE-12细胞分为正常组、模型组、奥司他韦组、高剂量组和低剂量组,除正常组外,其余4组均使用IAV感染,正常组加入等量病毒稀释液;2 h后弃病毒工作液,正常组和模型组加入病毒维持液,药物组加入用病毒维持液稀释的药物工作液,干预8 h后收集细胞。使用CCK-8检测细胞增殖情况;ELISA实验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达;免疫荧光检测细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达情况;RT-qPCR技术检测细胞内VEGF、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA表达情况;Western blot法检测细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS蛋白表达情况。结果CCK-8结果显示,不同浓度的木犀草素均能降低IAV感染所致的细胞损伤(P<0.01),其EC50值为7.204μmol/L,因此,将后续实验中的木犀草素药物浓度定为5μmol/L和2.5μmol/L。与正常组相比,模型组细胞上清液中TNF-α和IL-6升高(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度增强(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达升高(P<0.01);与模型组相比,高剂量组和低剂量组细胞上清液中TNF-α和IL-6降低(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度减弱(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达降低(P<0.01)。结论木犀草素能抑制炎性细胞因子的分泌,缓解IAV感染所致的细胞损伤,其过程可能与VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。

“调神畅志”法针刺对帕金森伴便秘模型大鼠结肠组织PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响

目的:探讨“调神畅志”针法对帕金森(PD)伴便秘大鼠结肠组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/AKT/eNOS)信号通路关键标志物(PI3K、AKT、p-Akt及eNOS)的影响,并探究此针法治疗的机制。方法:采用颈背部皮下注射鱼藤酮的方法制造PD伴便秘大鼠模型,并用APO诱导检测。40只造模成功大鼠随机分为模型组、西药组、常规针刺组与调神畅志组,每组10只,另空白组、假手术组各10只,共计60只,予相应干预4周。采用Western blot法检测各组大鼠远端结肠组织中PI3K、AKT、p-Akt蛋白表达和eNOS含量。结果:与空白组相比,模型组大鼠远端结肠组织中PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达显著降低,eNOS含量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,西药组、常规针刺组和调神畅志组远端结肠组织PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达均明显升高,eNOS含量均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与常规针刺组比较,调神畅志组PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达明显较高,eNOS含量显著较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:针刺能够改善PD伴便秘大鼠模型便秘症状,且调神畅志针刺优于常规针刺,PI3K/AKT/eNOS信号通路的激活是调神畅志针法的治疗机制之一,其作用机制是通过上调大鼠远端结肠组织中PI3K/AKT/eNOS信号通路中PI3K、AKT、p-Akt的蛋白表达和降低eNOS含量来实现的。

miR-375-3p过表达调控Akt-eNOS信号通路促进心肌梗死大鼠心肌修复作用机制

目的探究miR-375-3p过表达调控丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)-内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路促进心肌梗死(MI)大鼠心肌修复作用的机制。方法将大鼠分为假手术(sham)组、MI组、阴性对照(NC)组、miR-375-3p组,各10只。比较各组miR-375-3p相对表达、心功能指标[左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、短轴缩短率(FS)、左室射血分数(LVEF)]、心肌损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、肌钙蛋白(cTnT)I、脑钠肽前体(Pro-BNP)]、心肌梗死面积、心肌组织病理学变化及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达。结果与sham组比较,MI组、NC组miR-375-3p表达显著降低;miR-375-3p组miR-375-3p表达显著高于sham组及MI组(P<0.05)。与sham组比较,MI组、NC组及miR-375-3p组LVEDD、LVESD及LDH、cTnTI、Pro-BNP显著升高,FS、LVEF及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达显著降低,MI面积显著增加(P<0.05)。与MI组比较,miR-375-3p组LVEDD、LVESD及LDH、cTnTI、Pro-BNP显著降低,MI面积显著减少,FS、LVEF及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论miR-375-3p过表达可激活Akt-eNOS信号通路促进MI大鼠心肌修复。

eNOS基因单倍型与冠心病的关联性分析

目的:探索云南汉族人群内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因标签单核苷酸多态性(Tag SNPs)与冠心病(CAD)发病的关联性。方法:基于HapMap-CHB数据库(MAF>10%),以HaploViewr2≥0.8筛选出eNOS基因的6个标签SNP(rs1800783、rs1799983、rs743507、rs3918184、rs3918186、rs7830)。选取2012年1月—2015年12月云南省第二人民医院收治的冠心病患者514名作为冠心病组,以同期于该院行健康体检的健康体检者198名为对照组,收集2组受试者一般资料,采用Sequenom Mass ARRAY系统分析研究对象eNOS基因6个Tag SNPs的基因分型,并评估Tag SNPs与冠心病的潜在关联。结果:冠心病组体质量指数(BMI)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2组间6个eNOS基因Tag SNP基因型和等位基因分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)。多因素Logistic回归分析显示,矫正年龄、性别、血脂、血压、体质量指数后,rs1800783、rs1799983、rs743507、rs3918184、rs3918186、rs7830的显性、共显性模型均与CAD发病无关;单倍型分析结果显示,Hap1、Hap2、Hap3、Hap4、Hap5、Hap6、Hap7、Hap8、Hap9、Hap10与CAD发病无关(P>0.05)。结论:本研究尚不支持云南汉族人群eNOS基因多态性、单倍型与冠心病发生风险的关联性。

基于PI3K/Akt/eNOS信号通路探究孙氏助孕方治疗肾虚血瘀薄型子宫内膜大鼠的作用机制

目的:观察孙氏助孕方治基于磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮一氧化氮合成酶(eNOS)信号通路的研究机制。方法:选取广州市固堡生物科技有限公司提供的40只3个月月龄斯泼累格•多雷(SD)农场雌性大鼠进行研究,将所有大鼠按随机数表法分为正常组、模型组、对照组和观察组,每组各10只。观察组大鼠每天饮食自由摄入,其他组大鼠均予以造模,模型组未应用药物;对照组给予戊酸雌二醇疗法;观察组给予孙氏助孕方治疗。治疗后采集两组大鼠子宫内膜组织后,使用实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测PI3K、Akt、eNOS的mRNA基因表达水平及蛋白表达情况。对比两组大鼠子宫内膜厚度以及PI3K、Akt以及eNOS的mRNA基因表达水平及蛋白图像,分析孙氏助孕方对肾虚血瘀薄型子宫内膜的PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响。结果:与对照组比较,观察组大鼠的子宫内膜厚度差异不明显,差异无统计学意义(t=0.74,P>0.05);与模型组比较,观察组的大鼠子宫内膜厚度增高明显,差异有统计学意义(t=22.61,P<0.05);与正常组比较,观察组大鼠子宫内膜厚度稍低,差异无统计学意义(t=0.43,P>0.05);观察组大鼠的P13K、Akt、eNOS的mRNA基因表达水平、蛋白表达显著高于空白组,差异有统计学意义(t=10.10、21.71、18.13,P<0.05);而观察组大鼠的P13K、Akt、eNOS的mRNA基因表达水平、蛋白表达与对照组相比,差异无统计学意义(t=0.38、0.52、0.51,P>0.05);与对照组相比,模型组大鼠P13K、Akt、eNOS的mRNA基因表达、蛋白表达水平明显下降,差异有统计学意义(t=10.56,29.36,30.56,P<0.05)。结论:中药经验方“孙氏助孕方”可从血管生成的信号通路方面改善子宫内膜厚度的作用机制。

人静脉移植物eNOS和P-eNOS的表达

目的检测人静脉移植物中eNOS的表达及其活性。方法应用免疫荧光组织化学技术对30个静脉移植物再狭窄标本中eNOS的表达进行了检测,用抗磷酸化的eNOS抗体(P-eNOS)检测eNOS的活性。用激光共聚焦显微镜拍片,图片用Silicon Graphics Octane进行处理。结果在正常静脉血管中,eNOS在内皮细胞不表达;在病变静脉血管,在内膜增生早期,eNOS在管腔面内皮细胞的表达明显上调,在外膜小血管的表达也增加,随着内膜增生的不断发展,eNOS在管腔面内皮细胞的表达明显下降,外膜小血管逐渐从外膜向中膜延伸。免疫双重染色证实eNOS和p-eNOS的表达共同定位于内皮细胞。结论eNOS在静脉移植物中的表达模式提示其可能参与了中膜毛细血管的生成以及新内膜的形成。

纳他卡林激活内皮细胞ATP敏感性钾通道SUR2B/Kir6.1亚型对eNOS磷酸化的调节作用

目的 纳他卡林可选择性激活ATP敏感性钾通道（Katp）SUR2B／Kir6．1亚型，引起胞内ca2＋’浓度升高，一氧化氮合酶（eNOS）活性增强，NO释放增加。eNOS活性与eNOS磷酸化密切相关，研究表明eNOS-Serll77、eNOS-Ser635、eNOS-Set615磷酸化增强eNOS活性，eNOS-Thr495、eNOS-Serl16磷酸化抑制eNOS活性。本文研究纳他卡林激活Km对eNOS各磷酸化位点的影响，以此认识纳他卡林增强eNOS活性的作用特点。方法在培养的内皮细胞上给予（1）10^-9-10^-9mol·L^-1不同浓度的纳他卡林孵育5min，（2）预孵育0．01-1μmol·L。格列苯脲30min，给予1肛mol·L^-1纳他卡林孵育5rain，提取细胞总蛋白，用Western blot法检测eNOS-Serl177、eNOS-Ser635、eNOS-Set615、eNOS-Thr495、eNOS．Serll6磷酸化的变化。结果纳他卡林可浓度依赖性的升高eNOS．Serll77、eNOS，Ser635的磷酸化及eNOS．Thr495的去磷酸化，而对eNOS-Ser615和eNOS-Serl16磷酸化无影响。此作用可被K。特异性阻断剂格列苯脲拮抗。结论纳他卡林通过激活内皮细胞Katp，调节eNOS-Serll77、eNOS．Ser635的磷酸化及eNOS-Thr495的去磷酸化，但不影响eNOS-Ser615和eNOS-Serl16磷酸化，从而增强eNOS活性。

PI3K/Akt/eNOS信号通路在葛根素抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞组织因子表达中的作用

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信号通路在葛根素(puerarin)抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管内皮细胞组织因子(tissue factor,TF)表达中的作用。方法:实时荧光定量PCR检测TF的mRNA表达,Western blot检测TF和Akt的蛋白表达,硝酸盐还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)含量。结果:与对照组相比,ox-LDL孵育内皮细胞后,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化水平降低,细胞内NO产生减少;而葛根素预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF mRNA和蛋白表达下降,Akt蛋白磷酸化升高,细胞内NO产生增多;PI3K抑制剂LY294002和葛根素共同预孵育内皮细胞1 h后,再用ox-LDL孵育,内皮细胞TF的mRNA和蛋白表达升高,Akt蛋白磷酸化降低,细胞内NO产生减少;eNOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和葛根素共同预孵育内皮细胞,也明显阻断葛根素对ox-LDL诱导的内皮细胞TF mRNA和蛋白表达、细胞Akt蛋白磷酸化和细胞内NO产生的作用。结论:葛根素可通过上调PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞TF mRNA和蛋白表达。

大鼠急性肺损伤时iNOS mRNA和eNOS mRNA表达的时相变化

目的 :观察内毒素性急性肺损伤时肺组织中一氧化氮 (NO)和一氧化氮合酶mRNA的时相变化 ,并探讨其相互关系。方法 :用内毒素 (LPS)复制急性肺损伤模型 ,分别测定 0 .5 ,1,2 ,3,4h各组肺组织NO和丙二醛 (MDA)的含量 ;用原位杂交方法检测各组大鼠肺组织中诱导型一氧化氮合酶mRNA(iNOSmRNA)和内皮型一氧化氮合酶mRNA(eNOSmRNA)的表达水平。结果 :大鼠给予LPS后 ,①肺组织MDA含量随时间延长而逐渐增加 ,不同时点的均值互有差异 (P <0 .0 5 ) ,并且均显著高于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ;②各时点肺组织NO含量和iNOSmRNA表达量均显著大于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ,并且均在 2h时达到高峰 ,以后呈下降趋势。二者的变化呈显著正相关 (P <0 .0 1) ;③ 2h前 (含 2h)肺组织MDA含量随iNOSmRNA表达增加所致的NO产量增多而增加 ,2h后二者变化趋势相反 ;④各时点肺组织eNOSmRNA表达量与正常对照组比差异均无显著性。结论 :内毒素性急性肺损伤时 ,肺组织iNOSmRNA大量表达 ,导致内源性NO爆发式产生 ,从而介导肺损伤。NO产量在静注内毒素后 2h达到高峰 ,以后呈下降趋势。

小鼠皮肤切创愈合过程中iNOS和eNOS表达的免疫组织化学研究

目的观察小鼠皮肤切创愈合过程中,iNOS和eNOS在损伤区及损伤周边区内的表达及其变化规律。方法小鼠背部制作全层切创,应用免疫组织化学技术观察伤后切创组织中iNOS和eNOS的表达,并和无切创的小鼠作为对照。结果损伤区及损伤周边区细胞,伤后3h的损伤皮肤组织中可见少量的多型核细胞表达iNOS和eNOS,伤后6～24h,大部分浸润的中性粒细胞和单核细胞为iNOS和eNOS阳性。随着时间的延长,iNOS和eNOS阳性细胞以单核细胞和成纤维细胞为主。伤后3hiNOS的阳性细胞比率较低,6h～1d持续性增加并于1d达到最高峰,3～7d维持在一个相对稳定的水平直至伤后10d再次达高峰,10～14d开始下降。eNOS的阳性细胞率在伤后1～3h表达较低,6h～3d持续性增高,并在3d达到最高峰,在其后的5d内保持稳定表达,之后开始下降。而且损伤区及损伤周边区、特别是肉芽组织内的新生血管可见iNOS和eNOS不同强度的表达。结论小鼠皮肤切创愈合过程中,iNOS和eNOS在损伤周边区内多型核细胞、单核细胞和成纤维细胞中表达,其时序性变化可望用于皮肤损伤时间的推断。

枸杞多糖通过调控PI3K/Akt/eNOS信号通路对去卵巢大鼠心肌产生抗氧化作用

目的:观察枸杞多糖对去卵巢大鼠心肌PI3K/Akt/e NOS信号通路的影响。方法:将30只SD雌性大鼠随机分为假手术组、去卵巢组、补佳乐组、枸杞多糖高剂量组及枸杞多糖低剂量组,ELISA法比较各组血清雌激素、LDH及CK水平,检测心肌H_2S含量及氧化应激损伤相关指标,HE染色观察各组心肌的形态变化,Western blot法检测各组大鼠心肌e NOS蛋白及PI3K/Akt通路蛋白的表达。结果:与假手术组相比,去卵巢组大鼠血清雌二醇水平降低,心肌H_2S含量和GSH-Px活性下降,心肌e NOS蛋白及PI3K/Akt通路蛋白的表达均有所降低,心肌ROS活性和MDA含量升高(P<0.05),心肌细胞排列紊乱,细胞间隙增大,血清LDH和CK活性均增多;与去卵巢组比较,枸杞多糖高剂量组大鼠血清雌二醇含量增加(P<0.05),心肌H_2S含量、GSH-Px活性、e NOS蛋白及Akt磷酸化水平均提高,心肌ROS活性和MDA含量下降(P<0.05),血清LDH和CK活性均降低,并且改善大鼠心肌形态的变化。结论:枸杞多糖可以通过调控PI3K/Akt/e NOS通路改善去卵巢大鼠心脏变化防治绝经后心血管病变。

电针对局灶脑缺血再灌注大鼠大脑皮质eNOS mRNA及蛋白、MMP-9蛋白表达的影响

目的探讨电针对局灶脑缺血/再灌注大鼠脑内缺血皮质区eNOS mRNA及蛋白、MMP-9蛋白表达的影响。方法采用线栓法制备SD大鼠局灶脑缺血/再灌注模型。将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组。缺血2 h后把模型组和电针组分为再灌注1、3和7 d 3个时间点。取双侧"合谷"穴(LI 4)为电针刺激穴位。免疫组化法检测eNOS蛋白的表达;反转录聚合酶链法检测eNOS mRNA的表达;Western blot法检测eNOS、MMP-9蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型组、电针组各时间点大鼠缺血大脑皮质区eNOS蛋白及mRNA表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,电针组各时间点eNOS蛋白及mRNA明显增加(P<0.01)。eNOS蛋白表达于再灌注3 d达高峰,假手术组表达为0.4291±0.0173,模型组再灌注3 d表达为0.7374±0.0252,电针组表达为0.8536±0.0212,各组比较有显著差异(P<0.01)。与假手术组比较,模型组、电针组各时间点大鼠缺血大脑皮质区MMP-9蛋白的表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,电针组MMP-9蛋白的表达于再灌注1 d显著低于模型组(P<0.01),再灌注3、7 d电针组MMP-9蛋白的表达明显高于模型组(P<0.01)。结论电针可上调局灶脑缺血/再灌注大鼠缺血皮质区eNOS蛋白及mRNA、MMP-9蛋白的表达。

葛根素对心肌梗死大鼠心肌HIF-1、eNOS、VEGF基因表达及血清NO浓度的影响

目的:探讨葛根素诱导血管生成的分子机制。方法:通过大鼠心肌梗死动物模型,运用分光光度法检测血清NO水平;RT-PCR的方法检测心肌HIF-1、VEGF、eNOS mRNA的表达。结果:葛根素120 mg/kg腹腔注射4周能不同程度增加心肌梗死大鼠缺血区域和非缺血区域心肌VEGF mRNA、eNOS mRNA、HIF-1 mRNA的表达和血清NO的含量。结论:葛根素诱导血管生成作用的分子机制与其激活HIF-VEGF-AKT-eNOS-NO信号转导通路有关。