eSRK_s酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

为研究甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域高变区(eSRKs)的相互作用,构建了eSRKs基因的酵母双杂交诱饵载体,检测其自激活作用,并验证是否适用于后续的相互作用研究.以甘蓝B3为材料,通过RT-PCR技术获得eSRKs目的基因片段,将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-eSRKs;测序正确后,将重组质粒转入Y2HGold,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性以及对报告基因有无自激活作用,结果获得了正确的eSRKs基因片段,并成功克隆到pGBKT7诱饵载体中,且转化在有诱饵载体pGBKT7-eSRKs的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明表达产物对酵母细胞无毒性;显色反应结果表明对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测SCR蛋白与SRK蛋白胞外域高变区的相互作用奠定基础.

PCR步行法克隆油菜自交不亲和基因

同源序列法与PCR步行法相结合,在油菜中克隆自交不亲和基因SLG和eSRK(extra-cellularSRK)。所克隆的SLG序列长为882bp,克隆的eSRK序列长度分别为1495bp(青海大黄)、1494bp(黄籽沙逊)、1727bp(关中油白菜);其GeneBank登陆号分别为AY448025、AY448026、AY448027、AY448028、AY448029、AY448030。缺失突变可能是导致青海大黄和黄籽沙逊自交亲和的原因。克隆的SLG基因与甘蓝和白菜型油菜的SLG基因有很高的同源性,而eSRK基因与甘蓝和白菜型油菜的SRK基因的同源性较高。同源序列法与PCRwalking法相结合,可以有效地克隆基因;但在克隆SLG基因的两翼序列时遇到了困难,说明PCR步行法仍有待改进。

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16~421bp的片段和SCR第1876~2068bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。