肠出血性大肠杆菌O157∶H7 eae基因原核表达及间接ELISA的初步建立

对肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7 LEE毒力岛上的eae基因进行克隆与原核表达,以表达产物紧密素(intimin)为包被抗原,初步建立O157∶H7血清抗体间接ELISA。结果表明,抗原最佳包被浓度为0.88μg/mL,血清最佳稀释倍数为200;与鸡大肠杆菌其他血清型O1、O2、O11、O18、O35、O45、O78、O86、O88、O147、鸡白痢以及新城疫等血清均无交叉反应,该方法特异性较好;血清稀释倍数为1 600倍时仍能检测到O157∶H7 intimin特异性抗体,该方法灵敏度较高。

EHECO157∶H7基因文库中含eae基因的LEE克隆子的筛选

PCR扩增EHECO15 7∶H7eae基因的特异片段并制成杂交探针 ,采用斑点杂交和酶切方法从自构建的基因文库中筛选不含SmaⅠ的LEE片段。结果筛选到长约 2 3kb的LEE片段。表明筛选片段长度与预测不符 ,可能存在变异 。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7的紧密黏附素基因eae的测序及生物信息学分析

目的克隆编码肠出血型大肠杆菌O157∶H7的紧密黏附素eae基因,并对其进行测序及生物信息学分析,为研究EHEC与宿主细胞相互作用奠定基础。方法利用PCR技术扩增eae基因,经过纯化,将其定向插入克隆载体PMD19-Tsimplevector并进行测序,应用生物信息学软件分析其生物学特性。结果用PCR方法扩增eae基因,大小为2802bp,编码934个氨基酸,用DNAstar5.0软件分析紧密黏附素(Intimin)蛋白的生物活性,在202～210、510～520、716～735个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的亲水性,在175～220、300～315、550～610、710～780、825～880个氨基酸残基的肽链上具有良好的柔韧性,在220～300、615～710个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的抗原性。结论本研究用PCR法扩增出了O157∶H7的eae基因,成功构建了肠出血性大肠杆菌O157∶H7紧密黏附素eae基因的重组质粒,并分析了黏附素蛋白的亲水性、柔韧性、抗原性,为进一步研究大肠杆菌O157∶H7黏附素的致病机制奠定了基础,为下一步表达出Intimin蛋白,进一步研究该蛋白与宿主细胞的粘附、免疫原性、抗原抗体反应提供了理论依据。

毒力基因缺陷型大肠埃希菌O157:H7毒力和耐药分析

为了解引起人类疾病的大肠埃希菌O157∶H7的致病基因差别,文章在一名无其他基础疾病的腹痛、腹泻患者肛拭子中,通过细菌表型和核酸RT-PCR结合的鉴定方法,分离出一株毒力基因缺陷型大肠埃希菌O157∶H7,并对其毒力及药物敏感性进行分析。文章用Taq Man Array探针微流控芯片技术进行RT-PCR核酸检测,并对患者实施排除其他胃肠道致病菌和腹泻相关病毒的检测。研究发现,从该患者肛拭子中检测并分离出的一株基因缺陷型大肠埃希菌O157∶H7仅携带eae毒力基因,不携带stx毒力基因,且菌株无耐药现象。然而,这种仅携带eae基因、不携带stx基因的基因缺陷型大肠埃希菌O157∶H7,仍可引起人体较为严重的腹痛、腹泻临床症状,虽然病程相对较短,无严重致死性并发症,治疗相对容易。

用PCR鉴定大肠杆菌O157∶H7

根据大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的编码ｅａｅ蛋白的ｅａｅＡ基因和大肠杆菌编码Ｈ７抗原的ｆｌｉＣ基因的核甘酸序列，合成了２对寡核苷酸引物，建立了一个检测大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的ＰＣＲ方法。对１１株已知大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ；无运动性）株和其他不同属的４２株已知肠道致病菌的检测结果表明，该方法只从大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ）株的ＤＮＡ中产生预期的扩增产物，而从其他菌株的ＤＮＡ中未扩增出任何ＤＮＡ产物。该方法从基因水平直接确定大肠杆菌的血清型，特异性强，克服了以往血清学方法有非特异性反应的缺陷，为检测和鉴定大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＮＭ）提供了一个新方法。

肠出血性大肠杆菌O157P:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

目的获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用。方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性。结果获得了大小约2805bp的eae片段;构建了重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面。结论高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础。

表达EPEC紧密素蛋白重组嗜酸乳酸杆菌的免疫效果检测

【目的】制备抗肠致病性大肠杆菌(EPEC)的重组嗜酸乳酸杆菌,并初步探索其免疫效果。【方法】采用DNAStar软件选取EPEC E2348/69的eae全基因中抗原性较高的984bp片段(编码328个氨基酸残基,命名为eae Int328)为目标序列,以EPEC E2348/69基因组为模板,PCR扩增eae Int328基因,构建重组表达载体pSIP409-eae Int328,电转化法获得相应的重组嗜酸乳酸杆菌,采用SppIP诱导重组菌表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白。以BALB/c雌性小鼠为受试动物,灌胃重组嗜酸乳酸杆菌15d后,再灌胃EPEC,第21天,取结肠PP结和肠内容物,15和21d称体质量,同时设PBS(对照)、EPEC和pSIP409空载体转化嗜酸乳酸杆菌处理。采用流式细胞术检测结肠PP结中的CD11c+DC、CD4+T、CD19+B细胞比例,采用ELISA检测肠内容物中的特异性sIgA水平。【结果】克隆得到了984bp的eae Int328基因,构建了重组质粒pSIP409-eae Int328,制备了相应的重组嗜酸乳酸杆菌,用SppIP诱导表达后,重组嗜酸乳酸杆菌表达了分子质量约为36ku的重组蛋白,该重组蛋白与eae单克隆抗体可发生特异性结合。与EPEC和pSIP409空载体转化嗜酸乳酸杆菌组相比,21d时,pSIP409重组嗜酸乳酸杆菌组小鼠体质量显著增加,且与PBS组小鼠无显著差异。该重组嗜酸乳酸杆菌可显著提高BALB/c小鼠结肠PP结中的CD19+B细胞比例,极显著提高结肠PP结中的CD11c+DC和CD4+T细胞比例,使肠道黏膜产生针对EPEC的特异性sIgA。【结论】pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌通过CD11c+DC的介导,促进CD4+T细胞数量增加,进而诱导B细胞活化产生针对EPEC的特异性sIgA,进而对小鼠EPEC的急性感染发挥作用。

我国stx^-大肠埃希菌eae基因分型的研究

目的 了解我国大肠埃希菌LEE毒力岛eae基因的分子流行病学特征。方法 对从浙江省分离的 2 0株携LEE毒力岛大肠埃希菌株的eae基因 3′端部分以PCR法和限制性酶切法进行分型 ,未能分型的进行核酸序列测定 ,确定型别 ;对LEE毒力岛在染色体上的插入位点进行鉴定 ,对菌株进行ERIC PCR分型。结果 2 0株大肠埃希菌的LEE毒力岛的eae基因以β型为主 (占4 5 .0 0 % ) ,用限制酶切β型可进一步分为二个亚型 ,γ型eae与EHECO15 7∶H7933株的γ型eae酶切图谱差异较大。对未能用PCR法分型的 3株eae阳性大肠埃希菌菌株 ,其推定的intiminC端氨基酸序列分析结果表明 ,96 1株为γ 2型 ,C130 1株为ε型的新亚型 (C端序列与ε型最相近 ,一致性为 83.39% ) ,97 3株C端序列与α型最相近 (一致性为 5 8.0 6 % ) ,将其定为新的λ型。另外发现 97 3株中 ,1个IS2 0 0变种插入到eae和escD基因间隔区。 9株菌的LEE插入位点为selC ,其中 2株同时还存在完整的selC位点 ;另 11株可能存在着除selC和pheU以外的插入位点。几乎所有 2 0株菌间的ERIC PCR指纹呈现不同程度的差异 ,同一型的eae可出现在指纹相差很大的菌株中 ,但同时也存在着少量的携同型eae的同一克隆群菌株。结论 我国分离的stx- 大肠埃希菌eae基因在

不同来源肠致病性大肠杆菌(EPEC)分离株eae基因分析

目的了解我国不同来源肠致病性大肠杆菌分离株携带的eae基因型别。方法 PCR扩增eae基因,扩增产物测序后在NCBI中进行BLASTn搜索比对,确定其基因型别,并用最大似然法构建eae基因进化树,分析eae基因各型别间的相互关系。结果 130株EPEC菌株中,100株获得了1.8 kb序列,共分为18种eae基因型别,其中以β1型为主,占37%(含37株菌)。人源和动物源EPEC菌株存在相同的eae型别。结论我国EPEC分离株的eae型别呈多样性。

基于β-arrestin1沉默探讨益肾达络饮对EAE小鼠Rho/ROCK信号通路的影响

目的:基于β-抑制蛋白(β-arrestin1)基因沉默,研究益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠Ras同源基因家族蛋白(Rho)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路的影响。方法:60只C57BL/6雌性小鼠随机平均分为空白组、模型组、病毒组、益肾达络饮组(中药组)、病毒加益肾达络饮组(病毒加中药组)、醋酸泼尼松组(激素组)6组。除空白组外,每只小鼠均制备EAE模型,于免疫第4天病毒组、病毒加中药组每只小鼠尾静脉注射腺相关病毒(AAV)病毒溶液150μL(1×10^(11) vg·m L^(-1))。造模的第8天给药,空白组、模型组、病毒组给予生理盐水10 m L·kg^(-1),激素组给予醋酸泼尼松混悬液(3.9 g·kg^(-1)),其他组给予益肾达络饮(20 g·kg^(-1)),连续给药14 d并每日进行称重评分。免疫后每天记录各组小鼠的神经功能评分;苏木素-伊红(HE)染色测定小鼠脑组织、脊髓组织的炎症反应和病变位置;蛋白免疫印迹法(Western blot)测定EAE小鼠脊髓组织及脑组织中β-arrestin1、RhoA、ROCKⅠ的蛋白表达。结果:与模型组比较,病毒组、病毒加中药组的神经功能评分显著降低(P<0.01),中药组明显降低(P<0.05)。HE结果显示,模型组中枢神经系统(CNS)存在明显炎症反应,其他各组与模型组比较均有不同程度的减轻。Western blot结果显示,与空白组比较,模型组小鼠脊髓组织中β-arrestin1、RhoA及ROCKⅠ蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,病毒组、中药组、病毒加中药组、激素组小鼠脊髓组织中β-arrestin1、RhoA及ROCKⅠ蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠脑组织中β-arrestin1、RhoA、ROCKⅠ蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,病毒组、中药组、病毒加中药组、激素组小鼠脑组织中β-arrestin1蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);病毒组、中药组小鼠脑组织中RhoA、ROCKⅠ蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);病毒加中药组和激素组小鼠脑组织中RhoA、ROCKⅠ蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。结论:益肾达络饮可以改善EAE小鼠的临床症状,改善CNS的炎症反应,其机制可能为益肾达络饮抑制CNS中β-arrestin1的表达,从而降低Rho/ROCK信号通路中RhoA、ROCKⅠ蛋白的表达,并且益肾达络饮与抑制β-arrestin1的基因表达可能存在协同效果。

2023年浙江省杭州市一起由艾伯特埃希菌引起的学校聚集性疫情流行病学及病原学特征分析

目的了解2023年2月浙江省杭州市某学校发生的一起聚集性腹泻疫情的流行病学及病原学特征。方法对该起聚集性疫情开展流行病学调查,并采集腹泻患者肛拭子、食品留样及环境样品进行病原体快速筛查和分离鉴定,对分离的病原菌进行药敏试验和全基因组测序分析。结果本次聚集性疫情共造成22人出现腹泻、腹痛、呕吐等胃肠道症状。从6例腹泻患者肛拭子中分离到eae基因阳性菌株,经进一步鉴定确证为艾伯特埃希菌。6株菌对26种抗生素均敏感,核心基因组的多位点序列分型进化分析显示6株菌单独聚为一簇,且菌株间核心基因组的单核苷酸多态性差异仅在0~1 bp之间。结论这起学校聚集性腹泻疫情是由艾伯特埃希菌引起,为中国首次报道由艾伯特埃希菌引起的聚集性疫情。

云南省大理市家禽艾伯特埃希菌感染调查

目的了解大理市农贸市场家禽中艾伯特埃希菌的带染情况,为该病在大理市的预防与风险评估提供科学依据。方法2018年采集大理市不同农贸市场现宰杀活鸡的肠及内容物,经EC肉汤20℃增菌培养18~24 h后,PCR对其eae基因进行检测,阳性增菌液接种麦康凯琼脂分离纯菌,挑取eae基因阳性的疑似艾伯特埃希菌菌落进行三重PCR(clpX、lysP和mdh),并采用多位点序列分型(MLST)方法进行鉴定。结果共采集185份鸡肠及其内容物样品,检出8株疑似艾伯特埃希菌,经生化鉴定、三重PCR(clpX、lysP和mdh)、MLST分析表明该8株菌均为艾伯特埃希菌。采集样品的艾伯特埃希菌检出率为4.3%(8/185),其中以散养家禽居多的大关邑菜市场的检出率12.0%(6/50)最高,其次为古城区菜市场检出率为3.3%(1/30)。结论大理市不同农贸市场家禽中艾伯特埃希菌存在不同程度的带染状况,存在引起流行和暴发的风险。

海口不同农贸市场艾伯特埃希菌带染状况研究

目的了解海口市农贸市场家禽中艾伯特埃希菌的带染情况,为艾伯特埃希菌检测方法的有效性和可行性提供证据。方法采集海口市不同农贸市场市售鸡肠、鸭肠内容物经EC肉汤增菌后,PCR对其进行eae基因检测,阳性增菌液接种麦康凯琼脂,挑取eae阳性、不发酵乳糖菌落进行艾伯特埃希菌筛查后经三重PCR(clpX、lysP和mdh)及多位点序列分型(MLST)鉴定。结果本研究共采集了221份样品(鸡肠及其内容物133份,鸭肠及其内容物88份),从221份鸡肠、鸭肠内容物中检出11株疑似艾伯特埃希菌,经eae基因检测、生化鉴定、MLST聚类分析,结果表明该11株菌均为不发酵乳糖、木糖,无动力,eae基因和三重PCR为阳性,MLST聚类分析与艾伯特埃希菌标准菌株具有高度亲缘性,均鉴定为艾伯特埃希菌。结论海口市地区不同农贸市场家禽中艾伯特埃希菌存在不同程度的带染,且艾伯特埃希菌检测技术有效可行,具有推广应用价值。

马鞍山市非典型肠致病性大肠杆菌的鉴定及分子分型研究

目的通过常规鉴定方法和分子分析手段,了解马鞍山市非典型肠致病性大肠杆菌(a EPEC)的表型特征、菌株携带的eae基因型别及多位点序列分型(MLST)特征。方法病原学表型特征采用生化鉴定、血清学分型、药敏试验;分子生物学分析采用16s r DNA基因测序、PCR检测毒力基因、eae基因测序比对分型及MLST分型。结果 8株a EPEC测试菌生化特点与普通大肠埃希菌一致,1株菌产生H2S无法鉴定。1株菌为O26:K60,其余8株菌的血清学无法分型。药敏结果显示,44%仅耐氨苄西林,22%耐氨苄西林/舒巴坦和SMZ,其余均敏感。所有测试菌均为大肠杆菌,所有测试菌均携带uid A、eae基因而不携带stx1和stx2基因,均为a EPEC菌株。4株菌的eae基因无法分型,其余5株菌分别β1、β2、ε、ι1和ι2型。9株菌共产生6种ST型。结论马鞍山的a EPEC分离株的分子生物学特征呈现多样性,没有相对集中的遗传克隆群。

四川泸县艾伯特埃希菌的分离与鉴定

目的利用艾伯特埃希菌检测技术调查泸县地区家禽中艾伯特埃希菌的带染情况。方法采集市售鸭肠及鸡肠,肠内容物经EC肉汤增菌后,PCR检测eae基因,阳性增菌液接种麦康凯琼脂,挑取不发酵乳糖、eae阳性菌落进一步通过16S rDNA测序及MLST分析,确认为艾伯特埃希菌。结果本研究从147份鸡肠及内容物中检出12株疑似艾伯特埃希菌,经16S rDNA测序、MLST聚类分析表明该12株菌与艾伯特埃希菌参考菌株具有高度亲缘性,可证实为艾伯特埃希菌。结论本研究证实了泸县地区家禽中存在艾伯特埃希菌,表明艾伯特埃希菌检测技术有效可行,具有推广应用价值;获得的菌株为进一步推广研究艾伯特埃希菌生物学特征、流行病学等提供资源。

四川荥经县艾伯特埃希菌的分离与鉴定

目的按照自贡市疾病预防控制中心编制的艾伯特埃希菌的检测程序,对四川荥经县采集的鸡肠样品中艾伯特埃希菌的携带情况进行检测,了解该地区家禽中艾伯特埃希菌的携带情况及菌株特征。方法采集荥经县农贸市场、棒棒鸡店铺、活鸡宰杀点的新鲜鸡肠样品163份,按照艾伯特埃希菌的检测程序对样品进行检测,鸡肠内容物经EC肉汤增菌后,PCR检测eae基因,eae阳性样品的增菌液接种于麦康凯琼脂,37℃,24h培养后挑取不发酵乳糖、eae阳性的疑似菌株,使用多重PCR检测及多位点序列分析(MLST)对疑似菌株进行鉴定。结果自贡市疾病预防控制中心编制的艾伯特埃希菌的检测程序可行有效,在荥经县共采集了新鲜的鸡肠样163份品,从3份样品中分离到3株疑似艾伯特埃希菌菌株,经多重PCR检测及多位点序列分析(MLST)鉴定,3株疑似菌株均为艾伯特埃希菌。本次采集的样品艾伯特埃希菌的检出率为1.84%(3/163)。结论四川荥经县地区鸡肠中存在艾伯特埃希菌,分离到的菌株丰富了艾伯特埃希菌生物学特征、流行病特征研究的菌株数据库。

肠致病性大肠埃希菌分离株血清型多样性分析

目的了解不同来源肠致病性大肠埃希菌(EPEC)分离株的血清型。方法采用特异性PCR方法检测大肠埃希菌不同O抗原编码基因,并以全套O抗血清复核确定O血清群;以PCR扩增和测序H抗原编码基因,经序列比对后确定H型。结果 331株EPEC分离株中,共检测到81种O血清型,其中优势O血清群为O51,占6.0%(20/331),O145占4.5%(15/331);共检测到25种H型,其中优势H型为H11(8.2%)、H2(7.9%)和H19(7.9%)。最常见的血清型为O51∶H7和O26∶H11。来自腹泻患者、健康从业人员、动物和生肉类的EPEC分离株中,分别检测到63种、22种、25种和17种O血清群。腹泻患者、动物和生肉类中的优势血清群/型分别为O51(8.7%)、O145(15.7%)和O76∶H7(21.2%),而健康人员的分离株无明显优势血清群。结论我国EPEC菌株的血清型呈现极大的多样性,无明显的优势血清群(型),传统上依靠血清群(型)对EPEC进行判断的方法存在局限性。