兔肠致病性大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种有效检测肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)的荧光定量PCR检测方法,根据EPEC的eaeA基因序列设计了特异性引物和探针,对引物和探针的最佳浓度分别进行了优化,并研究了其敏感性、特异性和重复性。同时,应用该方法对临床兔粪样品进行了检测,并与国家标准推荐方法进行了比较。结果显示:本研究建立的EPEC荧光定量PCR检测方法检测阳性质粒的最低检测限为2.97拷贝/μL,批内重复和批间重复试验的变异系数均低于3%,临床样品的阳性检出数量高于国标推荐方法。结果表明,该方法特异性良好、敏感性高、重复性理想,能够准确检出兔粪球样本中的EPEC核酸,具有较好的应用前景。

新疆奶牛乳源大肠杆菌毒力相关基因eaeA的克隆及序列分析

从采自新疆乌鲁木齐市周边的5个奶牛场疑患隐性乳腺炎奶牛乳样,分离、纯化、鉴定出34株牛乳源大肠杆菌。根据GenBank发表的大肠杆菌16S rRNA序列和eaeA基因序列,用Oligo 6.0软件分别设计两对特异性引物,对分离菌株进行复检,并利用聚合酶链式反应(PCR)对eaeA基因进行扩增,结果10株为阳性,阳性率为29.4%(10/34)。将阳性样品进序列分析,结果与已发表的序列同源率为65%以上。与FJ609802株同源性较高,同源性75%。将阳性菌株用大肠埃希氏菌O抗原定型血清标定,以O21血清型的菌株eaeA基因阳性率较高。

致犊牛腹泻埃希氏菌eaeA基因克隆和序列分析

旨在确定新疆地区致犊牛腹泻病中埃希氏大肠杆菌的基因型。从采自阿克苏周边的3个奶牛场30份患腹泻的犊牛粪便中分离、纯化、鉴定出34株埃希氏大肠杆菌。根据GenBank公布的大肠杆菌的eaeA基因序列,用Oligo 6.0软件分别设计2对特异性引物,利用聚合酶链式反应,对所分离大肠杆菌eaeA基因进行PCR扩增。结果表明,有4株PCR产物为918bp的目的片段,阳性率为11.8%(4/34)。将阳性样品进行序列分析,结果与已发表的序列同源率为100%。所测序列呈递GenBank数据库,得到序列登陆号为JQ350701、JQ350702、JQ350703和JQ350704。

大肠杆菌O157:H7 eaeA基因的原核表达

将含广东分离株大肠杆菌O157∶H7 021210eaeA基因的克隆质粒双酶切后,亚克隆至原核表达载体pET-28 a(+),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,正确构建了原核重组表达质粒pET-eaeA.再将该重组质粒转化E.coliBL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,进行SDS-PAGE,结果显示,目的蛋白的相对分子质量约为94 000,与eaeA基因蛋白的理论值相符.破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式存在.表达蛋白经初步纯化,3次免疫新西兰兔,获得抗eaeA蛋白的多克隆血清.经琼脂扩散试验和W estern-b lotting试验,表明该蛋白具有较好的免疫原性和反应原性.

多重PCR方法检测大肠杆菌O157∶H7的初步研究

目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157∶H7的O157抗原基因(rfbE基因)、鞭毛H7抗原基因(fliC基因)、粘附素基因(eaeA基因)和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ(SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因)为扩增对象,设计能导至目的片段大小不同的5对引物,通过优化条件,建立了可用于粪便检测的大肠杆菌5重PCR。结果在同一扩增体系中,检测了5株不同来源的大肠杆菌O157∶H7及27株非大肠杆菌O157∶H7细菌。结果表明,该方法能从2株大肠杆菌O157∶H7中扩增出rfbEf、liC、eaeA、SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因,它们的大小分别为582 bp、802 bp、487 bp3、68 bp和177 bp。而另外3株大肠杆菌O157∶H7也能扩增出除eaeA、SLT-Ⅱ基因外的其它3个基因片段。表明该方法可用于检测大肠杆菌O157∶H7,还可检测细菌是否含有毒素基因。在检测27株非大肠杆菌O157∶H7,除O149出现SLT-II扩增产物和O1∶H7出现fliC基因扩增产物外,其它非大肠杆菌O157∶H7的扩增结果均为阴性,表明该方法有较高的特异性。当粪便样品经增菌培养12 h,用该5重PCR体系能检测出最初接种量为5cfu/g粪便的样品。结论本5重PCR方法具有较高的特异性和敏感性,可迅速、有效地将大肠杆菌O157∶H7与其它非大肠杆菌O157∶H7相区别,同时还能检测O157∶H7中的毒力因子。因此,通过进一步研究,本方法有望应用于临床大肠杆菌O157∶H7感染的辅助诊断。

大肠埃希菌O157∶H7 eae A基因的克隆及其表达质粒的构建

采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌O157∶H7021210的染色体DNA中扩增出eaeA基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2 800 bp的基因片段。T-A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET-eaeA。大肠埃希菌O157∶H7 eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及eaeA基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。

腹泻儿童粪便分离的大肠杆菌中eaeA基因的检测及携带eaeA菌株的特性研究

用碱性磷酸酶标记的ｅａｅＡ基因寡核苷酸探针，对３７个血清群的２２１株从肯尼亚５岁以下腹泻患儿粪便中分离的大肠杆菌进行检测，并对ｅａｅＡ基因阳性菌株进一步做了ｂｆｐＡ和ｓｌｔ基因检测，ＨＥｐ－２细胞粘附及荧光肌纤蛋白染色（ＦＡＳ）试验。结果表明，ｅａｅＡ基因的携带率为１９．５％，ＥＰＥＣ、ＥＨＥＣ和其它血清群中ｅａｅＡ基因的携带率分别为３１．６％、６６．７％和８．９％，根据ｂｆｐＡ和ｓｌｔ基因检测及ＨＥｐ－２细胞粘附和ＦＡＳ试验的结果，可将携带ｅａｅＡ基因的大肠杆菌分成５种类型。提示ｅａｅＡ基因的分布不仅限于ＥＰＥＣ和ＥＨＥＣ，而且携带ｅａｅＡ基因菌株含有多种毒力决定因子。

产志贺毒素大肠杆菌O18 XZ113株主要毒力基因eaeA、stx2、ehxA突变株的构建及其对小鼠的致病作用

【目的】探讨毒力基因eaeA、stx2、ehxA与产志贺毒素大肠杆菌O18致病力的关系。【方法】利用λ-Red重组系统,构建STEC XZ113株eaeA、stx2、ehxA基因缺失突变株并进行一系列生物学特性的研究。【结果】细胞粘附试验表明突变株XZ113△eaeA对HEp-2细胞的粘附能力明显降低;Vero细胞毒素试验表明突变株XZ113△stx2失去了使Vero细胞发生病变的能力;溶血活性试验表明突变株XZ113△ehxA无法在血平板上产生溶血圈,丢失了溶血能力。回复株在以上表型方面与野生株XZ113一致;与亲本株的体外竞争试验结果表明,突变株竞争力减弱,体内竞争结果表明突变株XZ113△eaeA被中度致弱;突变株XZ113△stx2和突变株XZ113△ehxA被高度致弱。【结论】stx2、ehxA基因在STEC O18 XZ113株的致病过程中发挥着更为重要的作用。

大肠埃希菌(EHEC/EPEC)紧密黏附素基因的分型分析

目的了解大肠埃希菌分离株eaeA基因的多态性。方法对不同来源的60株大肠埃希菌分离株的eaeA基因进行聚合酶链反应扩增后直接测序,测序结果在NCBI中进行BLASTn比对,根据比对相似性判定eaeA基因的型别。将获得型别的序列与GenBank中肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)和肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)代表性菌株型别的序列用Neighbor-joining法构建系统发生树,分析其进化关系。结果所有EHEC分离株的eaeA基因均为γ型,且序列完全一致。EPEC分离株的eaeA基因型以β1型为主,同时存在ε,κ,ι2,θ型。结论 EHEC分离株的eaeA基因相对保守,型别单一,而EPEC分离株的eaeA基因表现出较大的多态性。