将RGD模体改变为RGDNM可减弱Echistatin对血小板聚集的抑制但增强血管新生的抑制作用

为了研究去整合素echistatin RGD(Arg-Gly-Asp)模体周边氨基酸突变后对其生物学功能的影响,根据echistatin序列设计合成6个片段,利用重叠延伸PCR法合成cDNA,使echistatin RGD模体周边序列变为ARGDNM(D27→N),与载体pTXB1连接后转化E.coliBL21(DE3),建立echistatin(ARGDNM)的表达体系.工程菌经IPTG诱导后融合蛋白表达量占菌体总蛋白约30%,几丁质亲和纯化后,DTT裂解释放目的蛋白分子量约5.4kD.体外血小板聚集和体内鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)血管新生实验结果表明,echistatin(ARGDNM)抑制血小板聚集的作用减弱,而其抑制血管新生的作用增强.RGD模体周围氨基酸的改变影响了去整合素的生物学功能,echistatin(ARGDNM)增强了与αⅤβ3结合的特异性,本工作为研究特异性更强的去整合素药物奠定了基础.

Echistatin对人增生性瘢痕成纤维细胞的作用研究

目的研究Echistatin对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响。方法体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞,设Echistatin处理组和对照组,MTT法、流式技术及RT-PCR法检测人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果Echistatin可明显抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖,促进凋亡,降低Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结论Echistatin可作为防治增生性瘢痕的筛选药物。

去整合素echistatin对人晶状体上皮细胞增生、黏附、移行的影响

背景随着白内障手术的广泛开展，后发性白内障（PCO）的发病率逐渐升高，近年来的研究证实，去整合素类药物对PCO有抑制作用。目的探讨去整合素echistatin（Ecs）对人晶状体上皮细胞（LECs）株SRA01／04增生、黏附和移行的影响。方法取对数生长期的SRAOI／04细胞，培养液中加入不同质量浓度的去整合素Ecs（0、2．5、5．0、7．5、10．0、15．0、20．0mg／L）共培养细胞24、48、72h，用MTT法检测药物对细胞增生的影响及药物作用90rain后对细胞黏附的影响；对融合的细胞进行划痕试验，在倒置显微镜下观察并测量划痕宽度，干预培养24h、48h后测量记录划痕愈合情况。结果不同质量浓度去整合素Ecs（2．5、5．0、7．5、10．0、15．0、20．0mg／L）作用24、48、72h后对SRA01／04细胞增生的抑制率分别为2．6％、15．4％、21．2％、34．7％和46．1％、58．2％，6．6％、21．9％、38．2％、50．0％、60．7％、76．9％以及9．8％、29．0％、46．6％、63．4％、69．1％、92．4％。除2．5mg／L组外，各质量浓度组吸光度（A490）值与0mg／L组比较差异均有统计学意义（P〈0．05），且随Ecs作用时间的延长，细胞的A490值逐渐下降，差异有统计学意义（P〈0．05）；Ecs对各质量浓度组SRA01／04细胞的黏附抑制率分别为2．6％、15．0％、26．1％、35．3％、45．2％、54．5％，除2．5mg／L组外，各质量浓度组A490值与0mg／L组比较差异均有统计学意义（P〈O．05）；Ecs作用24h、48h后各质量浓度组SRA01／04细胞的移行距离与0mg／L组相比有不同程度的缩短，差异有统计学意义（P〈0．05），且随Ecs作用时间的延长，细胞移行距离缩短，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论去整合素Ecs可抑制人LECs的增生、黏附和移行，其作用呈剂量和时间依赖性，Ecs对PCO的防治可起到积极作用。

重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。

基因重组Echistatin发酵工艺的优化

目的:利用基因工程方法对一种蛇毒锯鳞蝰素蛋白的发酵纯化工艺进行优化,以提高目的蛋白的产量和纯度。方法:对工程菌进行发酵培养并诱导表达,研究不同的培养基、不同补料方式、溶解氧浓度、培养和诱导时间对工程菌产量和目的蛋白表达量的影响,利用几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,通过合适温度和pH裂解融合蛋白得到Ecs纯品,并鉴定和检测Ecs活性。结果:经过高密度发酵优化后,菌体湿重可达110g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的40%;亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为68mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。结论:通过发酵和纯化工艺优化,大大提高了目的蛋白产量,为进一步规模化研究和生产奠定了基础。

蛇毒蛋白Echistatin的C端突变基因的构建，表达及其活性研究

通过ＰＣＲ定点突变的技术，将蛇毒蛋白Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ基因的Ｃ端进行了突变（Ａｌａ４８→Ａｒｇ４８→，Ｔｈｒ４９→Ｖａｌ４９），模拟纤维蛋白Ｎ端的四肽（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｖａｌ），以期增加Ｅｃｓ（Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）的活性。突变的基因重组到表达质粒ｐＪＣ２６４上，经ＩＰＴＧ诱导，以ＣｈｅＹ－Ｅｃｓ融合蛋白方式进行了表达，表达量占菌体总蛋白的１５～２０％。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５初步纯化该融合蛋白，然后用ＣＮＢｒ裂解，透析，冻干，反相ＨＰＬＣ纯化Ｃ端突变体Ｅｃｓ蛇毒蛋白，Ｎ端十个氨基酸分析与天然的相符，在ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈｐｌａｓｍａ）测活体系中，１０μｍｏｌ／Ｌ的ＡＤＰ诱导，Ｃ端突变体Ｅｃｓ抑制血小板凝聚的活性约为野生型４倍。得到了Ｅｃｓ的Ｃ端突变后使Ｅｃｓ抑制血小板凝聚的活性提高的结果。

蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化

研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。

一种构建多拷贝串联小分子多肽基因的方法

目的:构建蛇毒锯鳞蝰血抑环肽(Ecs)基因串联多拷贝重组质粒。方法:采用重叠延伸PCR克隆Ecs基因,将第28位Met的密码子突变为Leu,利用其序列特点及酶切位点,在表达载体pET30a上将Ecs基因以同向串联方式连接,在E.coliBL21(DE3)中表达产物。结果:工程菌表达的串联Ecs与预期结果相符,实现了Ecs基因的串联表达。结论:为活性小肽的体外表达提供了新的思路和方法。

一种小肽的多顺反子串联表达方法

目的:构建蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)多顺反子串联多拷贝基因。方法:以pMD18T-Ecs为模板,利用三对引物分别扩增Ecs基因,每个Ecs基因都有独立的起始和终止密码子,然后通过三个Ecs基因之间合适的酶切位点使之串联,再与表达载体pET30a连接后得到三拷贝重组质粒,在三个Ecs基因之间分别有SD序列和SD间隔序列。将质粒转化E.coliBL21(DE3)后IPTG诱导表达,18%SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果。结果:Ecs的表达量占全菌总蛋白的18%,实现了Ecs的串联表达。结论:Ecs多顺反子的串联表达为小分子蛋白的体外制备提供了一种全新的思路和方法。

蛇毒锯鳞蝰素基因Leul4－Lys15－Glu16的定点突变

本研究的目的是利用蛋白质工程定点突变的方法，在蛇毒锯鳞蝰素基因分子上增加另一个保守序列ＲＧＤ（１４位精氨酸残基，１５位甘氨酸残基，１６位天冬氨酸残基），以其增加该分子的生物活性，并探讨蛋白质一级结构，空间结构和功能的关系。在质粒ｐＪＣ２６４的基础上，利用ＰＣＲ定点突变方法，对蛇毒锯鳞蝰素基因Ｌｅｕ１４－Ｌｙｓ１５－Ｇｌｕ１６进行定点突变，使相应的ＤＮＡ片段变成表达Ａｒｇ１４－Ｇｌｙ１５－Ａｓｐ１６的核苷酸顺序，经酶切和ＤＮＡ测序鉴定正确。ＣＮＢｒ裂解后，用反相ＨＰＬＣ分析，分离制备突变体蛇毒锯鳞蝰素，制备的突变体蛇毒锯鳞蝰素的Ｎ－末端１０个氨基酸残基与天然蛇毒锯鳞蝰素的相同。在人的富含血小板血浆测活体系中，经１０μｍｏｌ／Ｌ的ＡＤＰ诱导，突变体蛇毒锯鳞蝰素的ＩＣ５０为３．０×１０^（－７）ｍｏｌ／Ｌ；重组野生型蛇毒锯鳞蝰素的ＩＣ５０为４．０×１０^（－７）ｍｏｌ／Ｌ；天然蛇毒锯鳞蝰素的ＩＣ_（５０）为２．８×１０^（－７）ｍｏｌ／Ｌ。此外，就蛇毒锯鳞蝰素中保守序列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ以及其空间构象对蛇毒锯鳞蝰素抑制血小板凝集之间的关系进行了讨论。

几种靶向抑制整合素αvβ3多肽的设计及活性比较

目的设计6种靶向抑制整合素αvβ3的多肽,并对其活性进行初步评估。方法根据锯鳞血抑肽空间结构及相关技术方法,设计6种含RGD环(即精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列)的多肽,分别编码为cEchi-L-1、cEchi-L-2、Ω-Echi、Echi-L、cEchi-M、c Echi。经高效液相法(HPLC)进行纯化;Western blot法检测不同结直肠癌细胞中整合素αvβ3的表达,选择出表达量较高的细胞;MTT法对多肽活性进行初步评估。结果纯化后6种多肽纯度均> 95%。HCT 116细胞中整合素αvβ3的表达较高。多肽c Echi-L-1及c Echi-L-2对HCT 116细胞具有一定的抑制效果,IC50分别为59. 92和18. 33μmol/L。结论筛选获得了两条具有一定抗肿瘤活性的多肽,且锯鳞血抑肽C-末端序列的活性及RGD环之间的氨基酸数量可能影响多肽的抗肿瘤活性。