The complete genomic sequence of egg drop syndrome virus strain AAV-2

In the search for the genome of egg drop syndrome virus (EDSV-76) Chinese strain AAV-2, part of restrietion endonuclease physical map is analyzed, the complete genomic library is organized. On basis of this, the eomplete genome nueleotide sequences (32 838 bp in length, including terminal structures) are determined. The data analysis shows: compared with the other Adenoviruses, strain AAV-2 has more disparity on ganomic structure and the distribution of open reading frame (ORF). There are no elear E1, E3 and F4 regions in AAV-2 genome. Two segments located at both ends of genome (1.1 kb and 8.3 kb in length respectively) have no homology with the other adenovirus genomes. In addition, strain AAV-2 genome lacks ORFs encoding E1A, pⅤ and pⅨ, which are common ORFs encoding early, lately proteins in Adenovirus. This reveals differences between EDSA-76, the sole standard strain of group Ⅲ Avian Adenoviruses, and the other Avian Adenoviruses for the first time. It will help the search for Avian

减蛋综合征病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用

为建立快速检测减蛋综合征病毒(EDSV)抗体的方法,基于EDSV的Fiber蛋白,制备快速检测EDSV抗体的免疫层析试纸条,为养禽业提供针对病原微生物的感染预警及免疫评估。利用胶体金标记EDSV Fiber蛋白抗原为探针,将羊抗鸡IgG和抗Fiber蛋白的抗体包被到硝酸纤维膜上,分别作为质控线和检测线,对家禽EDSV抗体水平进行监测。结果表明,制备的EDSV免疫层析试纸条具有高度特异性,与其他家禽病毒抗体无交叉反应,仅与EDSV抗体反应,在试纸条上产生可见的检测线;并且制备的试纸条具有高度稳定性,在室温条件下可至少保存6个月。应用制备的检测EDSV抗体的免疫层析试纸条对从河南、安徽、山东等地养鸡场采集的576份鸡血清样本检测,与血凝抑制试验(HI)结果进行平行比较,二者的Kappa值为0.878,具有良好一致性。综上,制备的检测ESDV抗体的免疫层析试纸条具有高度的特异性、敏感性、稳定性和易操作性,对EDSV抗体的临床检测具有实际应用价值。

鸡减蛋综合征病毒中和性单克隆抗体的制备、鉴定及在双抗体夹心ELISA中的应用

为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2~7。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)效价最高达到1∶409 600,间接免疫荧光试验(IFA)效价最高达到1∶12 800。取效价最高免疫小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞,结合iELISA和IFA检测,经过多轮亚克隆,最终成功获得了2株稳定分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G12和10E11。iELISA结果显示,单克隆抗体9G12和10E11的腹水效价分别为1∶128 000和1∶1 020 000;IFA效价分别为1∶2 000和1∶8 000。Western blot检测结果显示,单克隆抗体9G12和10E11均不能识别变性的EDSV纤维蛋白,表明二者识别纤维蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体9G12和10E11均具有中和活性,中和效价分别为1∶2~7和1∶2~4。亚型鉴定表明,这2种单克隆抗体的轻链均为Kappa型,重链均为IgG1亚型。将基于单克隆抗体9G12和10E11建立的双抗体夹心ELISA方法应用于临床检测EDSV抗原,与荧光定量PCR检测结果的符合率为91.7%。综上,成功筛选出9G12和10E11杂交瘤细胞株,二者分泌抗EDSV特异性抗体,且这2种抗体具有中和EDSV感染活性,可应用于EDSV的临床检测。

致麻鸭产蛋下降的副粘病毒的分离和鉴定

从浙江省某麻鸭养殖基地产蛋锐减的病鸭生殖器官分离到1株致产蛋下降、不致鸭死亡的病毒株(YH99V)。该病毒易感蛋鸭,经SPF鸡胚传至第9代时致病性突然增强,第11代出现对鸡红细胞的血凝特性,通常在42～80h致死SPF鸡胚,EF15EID50为10-4.8。经磷钨酸负染电镜观察,YH99V粒子呈现圆形、杆状形、葫芦状形等多形态,直径70～400nm不等,病毒外表有囊膜,囊膜外层有排列整齐的纤突。病毒粒子和包涵体位于细胞浆内。病毒抵抗力由弱到强依次为0.2%甲醛、24h→56℃、45min→紫外线、1h→乙醚≈氯仿≈37℃、16h→pH9→pH5→1%Try。对人眼结膜易感,鸭眼结膜不易感。接种传代细胞BHK-21、IBRS-2均能引起细胞病变。YH99V株与同样引起鸭产蛋下降的AIV、鸭源EDSV无抗原相关性,而能被禽副粘病毒型阳性血清中和。根据试验结果,初步将YH99V判定为鸭副粘病毒。

一种从鸭新分离的黄病毒研究初报

从以产蛋下降为主的樱桃谷种鸭以及出现神经症状的雏鸭各分离出1株病毒,分别命名为BZ株和LC株。该2株病毒对SPF鸡胚和健康鸭胚均能产生相同的病变,分离病毒不能凝集鸡、鸭、鹅、鸽等的红细胞,在鸭胚成纤维细胞(DEF)能够产生典型的细胞病变(CPE),电镜下观察到约50nm的病毒粒子。病理组织学研究表明,二者在临床上均可导致脑组织危害,表现为脑膜水肿、血管充血和皮质层神经胶质细胞增生等。血清学检测表明,分离病毒与禽流感病毒(AIV)、鸭瘟病毒(DEV)、新城疫病毒(NDV)等病原无交叉。生物学特性鉴定该病原为有囊膜单股RNA病毒。利用不同禽病的特异性引物分别进行PCR或RT-PCR,均未扩增出特异条带。设计随机引物进行RT-PCR,扩增出基因片段,利用GenBank进行Blast同源比较,结果发现,分离病毒与以色列火鸡脑膜脑炎病毒(Israel turkey meningo-encephalitis virus,TMEV)和在马来西亚发现的Tembumu病毒至少在2段基因上具有较高的同源性,属于黄病毒属。测序表明,分离病毒与Tembumu病毒的非结构蛋白(NS5基因)和囊膜蛋白(E基因)的核苷酸同源性为86.7%～90.2%和87.0%～91.8%,与TMEV的NS5基因和E基因的同源性为72.4%～73.2%和72.7%～72.8%。2分离株之间E基因和NS5基因的核苷酸同源性均为99.5%。血清中和试验表明,BZ株阳性血清可以中和LC病毒,因此证实二者可能是同一种病毒。综合以上研究,建议将该病命名为"鸭病毒性脑炎"(Duck viral encephalitis disease)。

一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡

为探求2010年在上海、浙江和江苏等地鸭群出现产蛋下降甚至停止的发病原因,对浙江省4个发病鸭场发病鸭进行病理剖检以及病毒的PCR鉴定。解剖病鸭发现其脾脏肿大明显,肝脏有针尖状白色点状坏死。进一步的病理学变化分析发现病鸭的肝脏呈现程度不一的脂肪变性和空泡变性,肝细胞呈现局灶性溶解,脾细胞坏死。采集临床发病鸭的脾脏,提取总RNA,用随机引物进行反转录,然后用多种病毒的特异性引物进行PCR鉴定。结果显示,4个鸭场的病料呈鸭黄病毒PCR阳性,其他病毒呈阴性,说明这些鸭场均感染了鸭黄病毒,此病毒在浙江省已广泛流行。

鸭出血性卵巢炎的初步研究

2010年6月以来,我国部分地区所饲养的种鸭和蛋鸭发生一种疾病,以突发产蛋急剧下降为特点,根据病变,暂将该病称为鸭出血性卵巢炎（duck hemorrhagic ovaritis,DHO）。从不同地区的发病鸭群采集34份样品,取15份样品进行病毒分离,获得10个鸡胚分离物和5个鸭胚分离物。RT-PCR检测结果表明,15个分离物均为禽流感阴性,14个分离物为新城疫阴性。选分离株YY5株进行了电镜观察和PCR排查,结果表明,该毒株的毒粒直径为40~50 nm,呈鸭瘟病毒、水禽细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭甲肝病毒、鸭星状病毒、鸭圆环病毒、鸭冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒PCR阴性,但为黄病毒RT-PCR阳性。基于黄病毒NS1序列合成引物,用RT-PCR检测15株病毒分离物和其余19份临床样品,黄病毒阳性率为82.4%。用YY5株的221-nt NS1序列进行分析的结果显示,YY5株与黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群（Ntaya virus group）的巴格扎病毒（Bagaza virus）具有相近的遗传进化关系,但遗传距离介于病毒种的水平。用一株鸭胚分离株感染91日龄临近开产的麻鸭和232日龄的产蛋麻鸭,可复制出卵泡膜出血的病变。结果表明,从DHO自然病例分离到一种新的黄病毒,暂称为鸭黄病毒（duck flavivirus,DFV）,DFV可能与DHO有关。

减蛋综合征病毒pVⅢ基因和E3区序列测定及结构分析

克隆了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国分离株基因组ＨｉｎｄⅢ－Ｅ片段，并分析了其核苷酸序列。该片段位于基因组中央５８．７～６８．９物理图谱单位（ｍｕ），片段全长共３１９４ｂｐ。其中含有１个完整的和２个不完整的开放性读码框架（ＯＲＦ），分别编码ｐＶⅢ蛋白、１００Ｋ蛋白基因Ｃ端和纤维蛋白Ｎ末端部分。ｐＶⅢ蛋白基因由７５３个碱基（ｎｔ）组成，编码２５０个氨基酸（ａａ），编码产物的分子量为２８５００。氨基酸水平的同源性比较表明，ＥＤＳＶ的ｐＶⅢ蛋白与禽腺病毒１型（ＦＡＶ１）及人和其他动物腺病毒ｐＶⅢ蛋白的同源性为２８％～３６％，而与羊腺病毒（ＯＡＶ）的同源性高达５２％，提示ＥＤＳＶ与ＯＡＶ间的亲缘关系更近。按照人腺病毒基因组结构的特征，在ｐＶⅢ和纤维蛋白基因之间，应为Ｅ３区，但该序列只有２４５个ｎｔ组成，序列中保留了ＴＡＴＡＢｏｘ和ｐｏｌｙＡ信号。但除了２个仅编码４９ａａ和３２ａａ多肽的ＯＲＦｓ外，不编码任何产物，且核苷酸序列与其他腺病毒的Ｅ３区无同源性，证实此区无明显Ｅ３区样结构。

鸭产蛋下降-死亡综合征的临床诊断与病原的初步鉴定

2010年3～11月间,安徽省部分规模养鸭场流行以产蛋下降和死亡为特征的急性、热性鸭传染病,主要感染成年种鸭或蛋鸭,病理变化则以心肌出血、卵巢肿大、出血和坏死为特征。通过鸡胚接种、传代培养和RT-PCR鉴定,从发病鸭体内分离1株黄病毒。对其NS1基因扩增并测序,发现其与坦布苏病毒亲缘关系非常近,核苷酸同源性达94.2%。动物回归试验结果表明:该病毒能引起蛋鸭产蛋下降和卵巢病变。证明鸭黄病毒在我国对鸭的高度致病性,并开始在规模鸭场蔓延和流行,应当引起有关部门和兽医工作者的高度重视。

鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性脑脊髓炎四联油佐剂灭活疫苗的研究

用NDV La Sota株、IBV M41株、EDS76 V HSH23株、AEV Van Roekel株为种毒,分别接种鸡胚或鸭胚,制备各种病毒抗原液,经福尔马林灭活后,采用FILTRON盒式超滤系统对制苗病毒抗原液进行浓缩,然后按一定比例混合,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,制成ND-IB-EDS76-AE四联灭活疫苗。对四联苗各项技术指标进行了测定,证明本疫苗安全、无任何副作用;免疫10-14 d后产生免疫力;ND部分效检,攻毒100％保护,每羽份含ND效价达50-123 PD50;IB部分效检,免疫21-28 d后攻毒保护率达80％-100％,IB HI效价≥1:64;EDS76效检,免疫后21 d HI效价≥1:128;AE效检,保护率达80％-100％。

鸭黄病毒感染病例的病理组织学观察

为了探明湖北省肉种鸭和蛋鸭产蛋下降的原因,对引起产蛋下降的病鸭的卵巢中分离的病毒的目的基因进行测序,对3代接种的SPF鸡胚尿囊液进行电镜观察,对脑等组织进行组织病理学观察。序列分析结果表明,扩增的序列属于黄病毒的NS5基因,且与恩塔亚病毒群有相近的遗传进化关系。电镜可观察到40nm～60nm的有囊膜的病毒粒子。组织病理学观察发现输卵管出现严重的充血、出血和炎性反应,脑充血、炎性反应,心脏中有大量变性坏死的炎性细胞。

减蛋综合征病毒基因组Hind Ⅲ酶切片段的克隆及酶谱分析

以ｐＵＣ１９质粒为载体，采用鸟枪法克隆减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段，用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ标记的ＥＤＳＶＨｉｎｄⅢ片段探针打点杂交，证实１３个克隆插入了ＥＤＳＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢ片段。酶切分析结果表明，克隆到了Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ７个不同大小的片段，选取含有上述插入片段的、具有代表性的７个相应质粒ｐＵＨＡ、ｐＵＨＢ、ｐＵＨＦ、ｐＵＨＧ、ｐＵＨＨ、ｐＵＨＩ、ｐＵＨＪ，在分别以ＢａｍＨＩ、ＢｇｌⅡ、ＣｌａⅠ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ＸｂａⅠ、ＸｈｏⅠ单酶切的基础上，经适当组合的双酶切，得出各片段存在的单一酶切位点为Ａ：ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲＶ、ＳｍａⅠ、ＸｈｏⅠ位点；Ｂ：ＢｇｌⅡ、ＳｍａⅠ位点；Ｆ：ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲＶ位点；Ｇ：ＰｓｔⅠ位点；Ｈ：０；Ｉ：ＰｓｔⅠ位点；Ｊ：ＥｃｏＲＶ、ＸｈｏⅠ位点。为进一步筛选病毒复制非必需区，构建腺病毒表达载体，以及研究禽类腺病毒的分子生物学特性打下了基础。

减蛋综合征病毒五邻体重组蛋白的原核表达及抗原性鉴定

根据减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127株的全基因序列(GenBank序列号AC000004)设计了1对引物,采用PCR扩增出五邻体(Penton)完整基因,将其连接到克隆载体pMD18-T,经过鉴定后测序。序列分析表明,所获得的DNA片段核苷酸序列和GenBank中AV-l27株的五邻体比较有9个碱基突变,但利用DNAstar分析,两者的氨基酸完全一致。然后酶切胶回收后将目的片段连接到质粒表达载体pET-30a(+),获得的阳性克隆命名为pET-30a-Penton。将pET-30a-Penton转化E.coli Rosetta,经37℃、1.0 mmol·L-1 IPTG诱导表达5 h,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,结果显示目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为54.0 ku。Western Blot试验结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。

银加强胶体金探针检测鸡减蛋综合征病毒的研究

本研究首次报道应用银加强胶体金探针检测鸡减蛋综合征（ＥＤＳ７６）病毒获得成功。经初步提纯后的ＥＤＳ７６病毒免疫兔制备高免血清，按常规方法提取兔抗ＥＤＳ７６病毒的ＩｇＧ，成功地建立了检测ＥＤＳ７６病毒抗原的银加强胶体金探针法（ＳＥＣＧＰＡ），并确定了操作程序的最佳试验条件为：兔抗ＥＤＳＶＩｇＧ工作浓度为１４００，金标记羊抗兔ＩｇＧ的工作浓度为１２０，银染色的时间为１５ｍｉｎ。用该法对提纯的ＥＤＳ７６病毒（ＥＤＳＶ）抗原的最低检出量为０．１１７１９μｇ／ｍｌ。以此法检测了人工感染的５０只鸡采集的样本，对卵巢、输卵管峡部、咽喉部、软壳蛋的阳性率均为１００％，粪便阳性率为９２％，而检测鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等鸡源病毒和细菌样品时全部呈阴性反应。研究结果表明，该法具有快速、准确、操作简便、敏感性高、易于判读、特异性强、重复性好等优点。

上海地区近几年鸭新发病毒性传染病的血清学调查

于2003年从上海市5个区17个养鸭场(户)的鸭群中采集276份血清样品,采用进口ELISA试剂盒对冠状病毒、传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒的感染状况进行了血清学调查。结果表明,受检鸭群存有不同程度的阳性率,原来只感染鸡的疫病逐步向鸭群延伸。

鸡减蛋综合征病毒(EDSV-76)末端前体蛋白的基因结构分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒弱毒株ＡＡ－２，经常规方法提取其病毒核酸后，组建了完整的限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库，并对其中ＨｉｎｄⅢ（２１．０ｍ．ｕ．）－ＳａｃⅠ（３３．２ｕ．）进行了序列测定。同源比较分析证明：其Ｌ链含编码病毒末端前体蛋白，容量为５８０个氨基酸残基（ａａ）的开放读码框架（Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）。由此推导的多肽氨基酸序列及结构特点，如保守序列、核定位信号（Ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）。等与其他腺病毒的相应多肽存在较大差异。本文为阐明腺病毒末端前体蛋白参与ＤＮＡ复制起始的机制提供了新的依据。

减蛋综合征病毒33K蛋白基因克隆及结构分析

纯化的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ水解、０．８％琼脂糖电泳后，回收各ＤＮＡ条带并克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ载体，建立了ＥＤＳＶ基因文库，对３３Ｋ蛋白基因进行了分析。本研究证实，ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白基因含有２个外显子，与羊腺病毒（ＯＡＶ）３３Ｋ蛋白比较，Ｎ端编码产物的同源性为３０．８％，Ｃ端的为６０％。用ＲＴ－ＰＣＲ扩增３３ＫｍＲＮＡ和ｃＤＮＡ克隆及序列分析证实，ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白含有８２碱基（ｎｔ）的内含子，去掉内含子３３Ｋ蛋白基因能形成完整的ＯＲＦ，其编码产物由１７７氨基酸（ａａ）组成，推测分子质量为２．０６×１０４，与人５型腺病毒和ＯＡＶ的同源性分别为２８．１％和４４．７％。

产蛋下降综合征（EDS－76）病毒DNA探针的制备及应用研究

用纯化的产蛋下降综合征（ＥＤＳ－７６）病毒（Ｈ９１毒株）悬液提取的核酸，经琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量较大、背景清晰的核酸带。用ＢａｍＨＩ酶消化产生４个片段，大小分别为１７ｋｂ、１０ｋｂ、４．０ｋｂ和２．０ｋｂ。将其中的２．０ｋｂ片段克隆进ｐＵＣ１８ＤＮＡ载体中，重组质粒ＤＮＡ用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记作为ＤＮＡ探针，在ｄｏｔｂｌｏｔ中该探针不与鹅胚尿囊液核酸抽提物、马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＤＮＡ、鸡传染性贫血病毒（ＣＡＶ）ＤＮＡ、ＳＰＦ鸡基因组ＤＮＡ等核酸反应，只与３株ＥＤＳ病毒（ＥＤＳ标准毒株ＡＶ－１２７、ＥＤＳＨ９１毒株和从健康鹅体中分离的ＥＤＳＹ８１毒株）ＤＮＡ呈阳性反应。人工感染产蛋母鸡和雏鸡后２４ｈ即可用该探针从泄殖腔棉拭子样品中检测出ＥＤＳ病毒ＤＮＡ，在感染后３５ｈ仍能从部分感染鸡样品中检出。对部分探针检测阳性鸡的泄殖腔棉拭子样品用ＳＰＦ鸡胚分离病毒，并用ＨＡ和ＨＩ试验检测分离病毒的特异性；在感染过程中，同时检测了血清中ＨＩ抗体的消长情况。结果表明，人工感染鸡排毒至少可以维持２个月左右，而且血清中ＨＩ抗体即使很高，也不能阻止感染鸡的排毒。

鸡减蛋综合征病毒(EDSV)主要蛋白的结构分析

鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国株ＡＡ－２基因组全长为３２８３８ｂｐ，其编码病毒主要结构蛋白（５２／５５Ｋ、Ⅲａ、五邻体、ｐＶⅡ、ｐＶⅠ、六邻体、１００ｋ、ｐＶⅢ以及纤维蛋白等）的基因依次排列在基因组的中部，Ｅ２区编码ＤＮＡ结合蛋白、ＤＮＡ多聚酶、末端前体蛋白及ＩＶａⅡ的基因也分别排列在ＥＤＳＶ基因组的负链上。对这些蛋白的氨基酸序列进行同源性比较后发现，ＥＤＳＶ的主要蛋白与羊腺病毒（ＯＡＶ）同类物存在不同寻常的高同源性。

胶体金快速诊断方法对鸡减蛋综合征病毒的检测

选择15 nm的胶体金颗粒作为标记物,制备了鸡减蛋综合征病毒(EDSV)胶体金试纸条。该试纸条能检出浓度约为1.35μg/mL的纯化EDSV,用该试纸条检测135份临床样本,并与HA方法相比较,结果显示,二者的阳性符合率为89.8%。特异性试验结果显示,与鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应。表明,该试纸条用于检测EDSV具有快速、操作简便、特异性强等优点,可用于大批量抗原样本的检测。