竞争ELISA和间接ELISA方法应用于牛布鲁氏菌病净化的研究

旨在评价竞争ELISA方法和间接ELISA方法联合使用在布鲁氏菌病(以下简称“布病”)净化中的效果,为布病防控提供技术支撑。采用本实验室开发的动物布鲁氏菌病竞争ELSIA(cELISA)抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA(iELISA)抗体检测试剂盒及微量法补体结合试验(mCFT),对西北某牛场3 271份牛血清进行检测。本研究采用cELISA初筛、iELISA确诊的净化策略,对检测阳性牛进行淘汰,可疑牛和阴性牛在完全消毒后隔离饲养,并在前一次检测后每隔1个月重新对群体采样,进行多次连续的“检—淘”策略,在群体的个体阳性率低于2%或全部转阴后使用微量补体结合试验(mCFT)进行验证。并在群体全部转阴后继续检测2个月后确定净化结果。结果显示,首次检测阳性率35.36%的感染群体实施本净化策略后,在第1个月阳性率下降至25.41%,第2个月下降至7.16%,第3个月下降为1.86%,到第4个月则实现了布病阳性群体的全面转阴,mCFT验证个体阴性率100%。此后持续检测2个月,个体阳性率均为0,至此实现了感染群体的布病净化,使得群体内近一半的牛免于扑杀,大大减少了经济损失。综上发现,将cELISA用于布病初筛,iELISA用于布病确诊的联合使用,经多次连续检测并结合常规的隔离消毒措施,可以在短时间内实现对于布病感染群体的全面净化。

鸡毒支原体抗体间接ELISA检测技术的应用

该文主要探究ELISA检测试剂盒在鸡毒支原体检测中的应用。使用血清样品、鸡毒支原体菌株和SPF鸡等作为实验材料,分别进行灵敏性实验、重复性实验、抗体持续期检测、临床样品检测准确性检测和保存期实验。结果表明,ELISA试剂盒的灵敏性较好;重复性实验的稳定性达到预期;鸡在接种弱毒性疫苗后的35 d内,血清中抗体水平有明显上升;临床样品检测准确性较高;在保存期320 d内,ELISA试剂盒内试剂的敏感性和特异性良好。分析可得,使用ELISA试剂盒测试血清中的鸡毒支原体是可行的,并且具有操作简便、成本较低、效率较快的优势。

鸡传染性法氏囊病间接ELISA诊断试剂盒的研制及初步应用

采用 vero细胞增殖的 IBDV抗原建立了间接 EL ISA,用于定量检测 IBDV抗体。对该方法进行了标准化研究 ,确立了该方法的最佳工作条件。在此基础上研制了相应的诊断试剂盒 ,并对盒内各组分的性状、保存、质量控制以及诊断试剂盒的特异性、敏感性、可重复性、符合率、与国外同类产品的比较、保存期等进行了全面、详细的研究。结果表明 ,研制的试剂盒在 - 2 0℃保存至 6个月时各项性能都很好。该试剂盒与进口试剂盒对同样血清样品检测 ,符合率为86 .7%。间接 EL ISA试剂盒与琼扩试验的符合率为 92 .5 %。该试剂盒可对大量血清样品进行检测 ,操作简单方便、结果特异性强、敏感性高、快速 ,更适合于大型鸡场 IBD免疫抗体水平的监测及现地疫病诊断等需要。

重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA的研究 Ⅳ.与IDEXXELISA试剂盒及Westernblot的比较

利用重组N蛋白抗原建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的ELISA方法并组装成试剂盒,将试制的3批试剂盒分别与IDEXX生产的试剂盒及Western-blot进行了符合率试验。试验结果表明,所研制的试剂盒与Westernblot的符合率达97.67%以上。对460份临床血清分别用自制的试剂盒和IDEXX公司生产的试剂盒进行检测,其中有37份不相符合,用Westernblot对这37份血清进行验证,有35份血清检测结果与自制的试剂盒检测结果一致。由此表明,自行研制的试剂盒,其特异性和敏感性均能满足目前临床上该疫病的流行病学分析或免疫抗体检测。

氯霉素残留检测阻断ELISA试剂盒的研制及性能测定

在建立氯霉素单克隆抗体(CAP mAb)杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上,研制出CAP残留快速检测试剂盒(CAP-kit),并对其性能进行了测定。结果表明,CAP-kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R2=0.9953,检测范围为1.0μg/L～128.0μg/L,灵敏度为0.85μg/L,半数抑制浓度(IC50)为7.54μg/L,检测限为1.0μg/L;牛奶样、猪肉样的平均添加回收率为88.3%、82.5%,平均批内和批间变异系数均<15%;CAP-kit与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应(CR%)为150%,与其它酰胺醇类和抗菌素药物无交叉反应;试剂盒在4℃可保存6个月。

不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒-p27抗原结果的影响

为探讨不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒(ALV)-p27抗原结果的影响,试验首先对180日龄地方品种母鸡的泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原进行ELISA检测,选取部分阳性鸡和阴性鸡进行分组试验,采用ELISA对试验鸡血清、蛋清和病毒分离的细胞培养液进行ALV-p27抗原检测,采用RT-PCR方法检测血液ALV特异性基因。结果显示,阳性组中以血清、蛋清和细胞培养液作为ELISA ALV-p27抗原检测材料,其检测阳性率均低于泄殖腔棉拭子,血清检测的阳性个体包含全部蛋清和细胞培养液ELISA检测的阳性个体。ELISA检测数据的相关性分析显示,只有血清和细胞培养液检测数据间存在显著性相关,线性关系方程为Y(细胞上清)=1.8439X(血清)-0.1469,R2=0.937;阳性组中ALV-p27基因检测阳性率低于泄殖腔棉拭子,但高于血清、蛋清和细胞培养液,其包含所有血清ELISA检测的阳性样品;外源性ALV-J gp85基因阳性率仅为29.17%,且阳性样品均属于血清ELISA阳性样品。综上所述,成年鸡以泄殖腔棉拭子作为ELISA ALV-p27抗原检测材料存在假阳性结果,蛋清和细胞培养液作为检测材料存在漏检的可能,血清作为ELISA检测材能够更准确地反映成年鸡群ALV感染状态。

链霉素残留检测ELISA试剂盒的研制及应用

本研究采用EDC法人工合成链霉素抗原（SM—BSA），免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术获得了分泌抗链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，建立了快速检测链霉素（SM）残留的酶联免疫方法，并成功研制了试剂盒。然后对其灵敏度、准确度、特异性、基质效应性等技术指标进行检测，同时应用该试剂盒对生长猪尿液中的残留情况进行检测。结果表明：除双氢链霉素外，该试剂盒与其它抗生素类药物均无交叉反应；线性检测范围为1～1289g／L，相关系数R^2=0．9251，灵敏度为0．45μg／L，半数抑制浓度（IC50）为7．769g／L，检测限为19g／L；猪尿样的平均添加回收率为84．1％；基质对该试剂盒的检测结果影响不大。该试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合于SM残留的快速检测，具有较高的推广应用价值。

牛传染性鼻气管炎间接ELISA诊断方法的建立

以牛肾细胞系(MDBK)培养牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)Bartha Nu/67株,经超速离心纯化病毒,再经超声破碎处理后作为诊断抗原,建立了检测牛血清IBRV抗体的间接酶联免疫吸附试验。该ELISA的判定标准为:血清D490 nm值大于0.369的判为阳性,小于0.295的判为阴性,在0.295与0.369之间的为可疑。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性高、重复性好。与法国进口ELISA抗体诊断试剂盒比较,其符合率为96.3%;与中和试验比较,符合率为95.8%,且敏感性更高。应用该诊断方法调查了我国部分地区IBRV的感染情况,结果显示,这些地区的IBRV感染率为67.1%。

重组抗原rMIC3-ELISA检测猪弓形虫抗体的研究

[目的]探讨检测猪弓形虫病的新方法。[方法]应用纯化的重组弓形虫微线体蛋白3(rMIC3)作为包被抗原建立间接ELISA方法,用于猪弓形虫抗体的检测。[结果]该法所用最佳抗原浓度为3.40μg/ml,最适宜的血清稀释倍数为1∶160,与猪瘟病毒等阳性血清不发生交叉反应,与LAT的符合率为92.56%。[结论]该方法快速、特异、重复性好,可用于猪弓形虫病的诊断和流行病学的调查。

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

利用纯化的重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白作为检测抗原,建立一种间接ELISA方法用于血清抗体检测。昆虫细胞株(Sf-21)接种重组杆状病毒,对蛋白表达参数及纯化工艺进行了优化,制备了5批重组蛋白抗原,表达量占总蛋白的18.7%左右;Ni2+亲和层析柱纯化获得重组蛋白纯度为90.1%;重组蛋白可被特异性抗体识别,具有良好的免疫活性。用建立的ELISA法对30份已知阴性血清样本检测临界OD405nm值为0.343;ELISA与IPMA对150份血清进行平行检测符合率为95.3%,特异性为91.2%,敏感性为96.5%;与其他几种常见猪病毒参考血清无交叉反应。组装的试剂盒批内和批间变异系数分别为4.0%～4.8%和8.9%～9.9%;置-20℃保存12个月稳定。试剂盒对人工感染猪血清检测结果,接种后第5周抗体阳转,第8周～9周抗体水平达到高峰;对来自黑龙江、吉林、河北、上海等地猪场1085份血清抗体检测,阳性率为73.6%。研制的ELISA试剂盒为临床PCV2血清抗体检测及疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

三种伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒的比较

为比较3种品牌(A、B、C)伪狂犬病病毒(PRV)g E抗体ELISA检测试剂盒的临床使用效果,应用中和试验来标定伪狂犬病非免疫猪场的180份临床血清样品,同时用3种试剂盒进行检测,并对试剂盒的重复性、敏感性、特异性以及与中和试验结果的符合度等指标进行测定与分析。结果显示:3种试剂盒的批内稳定性均较好,变异系数均小于10%;批间重复性差异较大,变异系数最小者为8.09%,最大者高达21.31%;3种试剂盒的诊断特性良好,敏感性为95.56%~97.78%,特异性为94.44%~100%;各试剂盒检测结果与中和试验结果均完全相符(Kappa值为0.91~0.96)。比较结果表明,3种试剂盒均适用于临床样品的PRV g E抗体检测,其中稳定性及敏感性俱佳的试剂盒C更适用于PRV的持续监测、早期发现、引种检疫及净化效果评估,而特异性与准确性最高的试剂盒B更适用于贵重病畜的诊断淘汰。因此,生产实践中应根据诊断目的合理选择最适试剂盒。

莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺（RAC）偶联于牛血清白蛋白（BSA）,合成免疫原BSA-RAC,并用紫外和凝胶电泳鉴定;用BSA-RAC免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗RAC单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备RAC mAb。应用RAC mAb研制RAC残留快速检测阻断ELISA试剂盒（RAC-Kit）,并测定其性能。结果表明,BSA-RAC偶联成功,分子结合比为1∶24.5;筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的4D8株的亲和常数Ka为1.65×1010L/mol。RAC-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1~170μg/L,灵敏度为0.52μg/L,检测限为1μg/L,饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为91.1%和89.2%,平均批内和批间变异系数〈15%,与多巴酚丁胺的交叉反应率为22.3%,与其他化合物无交叉反应,RAC-Kit在4℃可保存180d。

磺胺二甲基嘧啶残留快速检测阻断ELISA试剂盒的研制及其性能测定

应用磺胺二甲基嘧啶(SM2)单克隆抗体(mAb)成功研制出SM2残留快速检测阻断ELISA试剂盒(SM2-Kit)。研究结果表明,SM2-Kit的标准曲线呈典型的S型,相关系数R2=0.9911,符合4参数logit曲线拟合,线性检测范围为0.625μg/L～80μg/L,灵敏度为0.9μg/L,半数抑制浓度(IC50)为5.82μg/L,检测限为1μg/L;饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为83.4%、89.5%,平均批内和批间变异系数均低于15%;SM2-Kit与磺胺甲基嘧啶的交叉反应率(CR%)为2.08%,与其它磺胺类药几乎没有反应性;基质对SM2-Kit的检测结果影响不大;试剂盒在4℃可保存6个月。

重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体的ELISA研制——Ⅲ.ELISA试剂盒保存条件

对应用重组N蛋白抗原检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的EL ISA诊断方法的主要成分(抗原包被板、酶标二抗、阳性血清、阴性血清)及组装成的试剂盒的保存条件进行了摸索。分别用5种方法对抗原包被板处理,结果表明用真空包装机抽真空后充入氮气法处理效果最好;酶标二抗在酶标抗体保存液中保存,能很好地保持EL ISA测定结果的稳定性。对其他试剂盒组成成分的保存期分别测定后,组装成试剂盒,测定试剂盒的保存期为12个月。

玉米细菌性枯萎病菌改良Dot-ELISA检测研究

通过激光切割技术加工出硝酸纤维素膜小圆片并粘贴在已打孔的塑料胶条上,制成包含8个圆片的NCM条(NCM test strip),进一步在NCM条上建立了玉米细菌性枯萎病菌的Dot-ELISA检测方法。研究发现,在NCM圆片上的Dot-ELISA检测灵敏度与点样量密切相关,采用10μL/点的加样量比通常的1μL/点可提高检测灵敏度10-100倍;间接Dot-ELISA的检测灵敏度是双抗夹心dot-ELISA的10倍,该结果进一步在微孔板ELISA的检测中得到证实。玉米细菌性枯萎病菌的改良Dot-ELISA检测是一种较为灵敏、快速、稳定、规范的实验方法,为进一步研究该病菌的微流控芯片斑点免疫检测方法奠定了前期工作基础。

几种弓形虫ELISA试剂盒初步检测结果比较

本文选用 5种国内弓形虫 EL ISA试剂盒检测已知同样样品 ,并且用国外试剂盒核查由该 5种试剂盒提供的阳性样品 ,作试剂盒质量比较。结果 Ig G- EL ISA试剂 A、B盒阳性检出率 (敏感性 )均为 6 0 % ,A、B盒之间的符合率仅为5 0 % ,其特异性分别为 35 %和 90 % ;C、D、E阳性检出率 (敏感性 )分别为 30 %、6 0 %、70 % ,特异性分别为 75 %、5 4%、87%。核查 A、B、D、E盒提供的样品结果 :Ig G符合率较好 ,均在 90 %以上。 Ig M符合率均为 6 0 %。鉴于目前国内 EL ISA试剂盒的现状 ,本文分析后建议 ,除改进质量外 ,宜选择多种试剂盒联合应用 ,避免漏检和误诊。

ELISA、GICA与MEIA法检测新生儿TORCH-IgM抗体的比较

目的比较ELISA、GICA与MEIA法对新生儿TORCH-IgM抗体的检测效果。方法选择120例疑似TORCH感染的新生儿作为研究对象,分别采用ELISA、GICA与MEIA三种方法检测血清TORCH-IgM抗体,比较三种方法对新生儿TORCH-IgM抗体检测的阳性率、符合率、灵敏度以及特异性。结果以MEIA法为金标准,ELISA法和GICA法检测TORCH-IgM抗体的灵敏度和特异性比较,ELISA法检测中的RV-IgM、HSV-IgM以及CMV-IgM检测的灵敏度均高于GICA法(P<0.01),两组的TOX-IgM检测比较无显著性差异(P>0.05);ELISA法检测中的CMV-IgM检测的特异性高于GICA法(P<0.01);ELISA法和GICA法检测TORCH-IgM抗体阳性预测值和阴性预测值比较,ELISA法中CMV-IgM检测的阳性预测值和阴性预测值均高于GICA法(P<0.05),尤其是阴性预测值(P<0.01);与MEIA法检测总符合率均在90%以上。结论 ELISA法检测新生儿TORCH-IgM抗体,具有特异性强、敏感性高、可信度高、简单易行等优点,是一种比较可靠的新生儿TORCH感染筛查的检测方法。

苏丹红Ⅰ直接竞争ELISA检测试剂盒的研制

直接包被多克隆抗体建立了苏丹红ⅠELISA检测技术,研制苏丹红ⅠELISA检测试剂盒。结果表明,制备的多克隆抗体对苏丹红Ⅰ亲合力强、特异性高,试剂盒标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1.55～100μg/L,50%抑制率(IC50)为13.52μg/L,灵敏度(IC10)为1.95μg/L,平均批内与批间变异系数分别为7.6%与10.6%,与苏丹红Ⅱ、Ⅲ的交叉反应率分别为4.40%和1.70%,与苏丹红Ⅳ及其他违禁食品染色剂交叉反应率低于0.01%;干辣椒、辣椒粉、辣椒油与辣椒酱等4种样品的苏丹红平均添加回收率分别为88.1%、91.4%、78.2%和84.3%,最低检测限分别为1.82、1.71、2.19和2.12μg/kg;与HPLC检测方法具有较高的相符性,4种样品相关系数分别为0.95,0.94,0.86和0.87;该试剂盒在4℃下至少可保存180d,可用于辣椒及其制品中苏丹红Ⅰ的批量快速低成本筛查。