大鼠骨髓干细胞的分离、培养和诱导生成内皮祖细胞的研究

目的探讨大鼠骨髓干细胞的体外分离、培养和诱导生成内皮祖细胞的的可行性,并检测其表型和功能。方法取大鼠长骨骨髓细胞,第3代细胞传代后加用终质量浓度10μg/L的血管内皮生长因子(VEGF)的细胞因子,培养3 d后行内皮细胞特异性成分鉴定。结果(1)免疫组化染色鉴定:P3代CD133呈中度阳性表现,CD34呈弱阳性表现;经VEGF诱导后表达明显增强。(2)流式细胞仪细胞计数鉴定:P3代CD133、CD34阳性细胞率分别为97.3%、55.5%;经VEGF诱导后CD133、CD34阳性细胞率分别为91.4%、78.6%。(3)P3代VEGF诱导后乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)、荆豆凝集素(UEA)双染鉴定:经VEGF诱导的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(70.2±5.1)%,未经VEGF诱导后的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(20.4±3.8)%。(4)RealTime-PCR检测第3代VEGF cell和三代cell的内皮细胞特异性成分表达:P3 VEGF cell血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)浓度是P3cell的2.22倍。结论用贴壁筛选法和VEGF细胞因子培养大鼠骨髓干细胞可以获得较高纯度的内皮祖细胞(EPCs),该细胞具有内皮祖细胞的特性,可用于进一步向内皮细胞分化的研究与应用。

鼠ho-1真核表达载体的构建、鉴定及其在骨髓来源的内皮祖细胞中的表达

目的制备高效表达的血红素氧合酶（HO）-1基因修饰的骨髓来源的内皮祖细胞（EPCs）。方法应用基因重组的方法构建ho-1真核表达质粒pCMV—Tag2B／ho-1，用脂质体将其转入骨髓来源的EPCs，用荧光显微镜和Westernblot等方法检测HO-1蛋白的表达。结果（1）逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）产物电泳结果，质粒菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定结果证实ho-1真核表达质粒构建成功；（2）根据体外培养的骨髓来源的EPCs形态学变化，细胞的CD133、CD34和VWF免疫组织化学染色鉴定，VEGF诱导后LDL、UEA双染鉴定等证实所分离的细胞为EPCs；（3）vegfa转染P3代EPCs后细胞内荧光明显增强，Westernblot检测显示转染细胞HO-1蛋白抗体结合蛋白出现明显印迹条带。结论成功制备表达外源性基因ho．1的骨髓来源的EPCs，制备方法可行。