黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究

增效蛋白(ENHANCIN)是一种主要在昆虫杆状病毒中存在的杀虫增效因子,黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulovirus,AgseGV)基因组中有一个ORF的编码产物为杆状病毒ENHANCIN同源物,命名为en-hancin-like。生物信息学分析结果表明,AgseGV的enhancin-like基因编码产物含有ENHANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a-螺旋跨膜区,在其C-末端拥有类似哺乳动物的脯氨酸富集区。为了确定AgseGV的EN-HANCIN-like蛋白是否具有增效功能,构建了AgseGV的enhancin-like全基因和5′端片段(1 017bp)的原核表达载体。利用层析技术纯化截短片段的原核表达产物,以其为抗原制备了抗体。利用自制抗体和His-tag抗体,Western blot检测了enhancin-like全基因的表达产物。结果表明,在融合蛋白预期大小处显示出阳性条带,证明目的基因得到了良好的表达。以棉铃虫为供试虫进行生物测定,证明在棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)浓度为1.17×102 PIBS/mL时,AgseGV enhancin-like的全基因原核表达产物能使其感染3龄初幼虫的死亡率提高16.25%,增效作用显著。但是,5'端截短片段的原核表达产物对HaNPV没有增效作用。

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因5′端截短片段的表达及增效活性测定

将带有棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白 (HaGVenhancin)基因的重组表达载体 pET 30a En分别用BalⅠ和DraⅠ酶切后连接 ,构建重组表达载体pET 30a Ben和 pET 30a Den ,其外源基因的开放阅读框分别为HaGV增效蛋白基因 5′端的 1 7kb和 2 2kb。IPTG诱导表达产生 66 7kD和 85 1kD的多肽并命名为Ben和Den。初步纯化的Ben和Den显示了对棉铃虫核多角体病毒 (HaNPV)及Bt的增效活性。Ben可对棉铃虫核多角体病毒增效 1 0 5%～2 6 5% ,LT50 缩短 0 9d ,Den增效 1 0 2 %～ 33 0 % ,LT50 缩短 1 2d～ 1 9d。重组增效蛋白可对Bt(1∶2 50 0稀释 )增效 2 0 7%～ 35 4% ,Den增效 1 6 7%～ 31 5% ,Ben增效 1 1 7%～2 7 4%。

鞘翅目害虫-华北大黑鳃金龟围食膜结构的初步研究

应用光学显微镜和生化技术，研究了华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）围食膜的基本结构和表面形态，初步分析了围食膜蛋白质的种类，蛋白质和糖的含量，测定了棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白对围食膜结构的影响。结果表明，华北大黑鳃金龟围食膜表面平滑致密，富有弹性，但与多数昆虫围食膜相比韧性较差，主要由蛋白质、糖和几丁质组成，其中蛋白质的含量约为36．25％，糖的含量约为8．91％，其他为几丁质等；经SDS—PAGE测定，围食膜的蛋白质种类较多，有28条多肽比较清晰，分子量多在17．6—320．3kDa。棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白不能降解华北大黑鳃金龟围食膜中的蛋白质。

粉纹夜蛾颗粒体病毒增效基因3′端2.5kb片段在大肠杆菌中的表达

将粉纹夜蛾Trichoplusiani颗粒体病毒增效基因 3′端 2 5kb片段插入 pQE 31中构建了重组表达载体 pQE/enhancin ,转化大肠杆菌M 15( pREP4 )在IPTG诱导下成功表达出分子量约为96kD的融合蛋白并命名为P96。初步纯化的P96显示了明显的增效活性 ,可提高棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫 3龄幼虫感染死亡率 2 7 4 0 %～ 34 50 % ,缩短LT50 1

粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白锌离子结合域定点突变

粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusia ni granulovirus,TnGV)增强蛋白(enhancin)具有增强病毒感染力的作用。该蛋白包含一个多种杆状病毒增强蛋白都具有的保守结构域HELGH,是典型的金属蛋白酶锌离子结合域,但该结构域对增强蛋白生物活性的重要性尚未得到研究。本研究通过定点突变构建了该结构域的5个氨基酸分别突变为2种不同氨基酸的共10种增强蛋白突变体基因,并用杆状病毒载体进行了重组表达。活性测定发现,10种突变型增强蛋白大部分都丧失了野生型增强蛋白所具有的降解粉纹夜蛾幼虫围食膜粘蛋白的生物学功能,只有1种(第4位G突变为A)保留该生物学活性。这一结果表明锌离子结合域对增强蛋白生物活性具有重要作用,也提示增强蛋白确是一种金属蛋白酶。

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.1kb片段在大肠杆菌中的表达

以棉铃虫颗粒体病毒 (Helicoverpaarmigeragranulosisvirus,简称HaGV)基因组DNA为模板 ,设计引物PCR扩增病毒增效蛋白 (Enhancin)基因 ,然后经SacI/PstI双酶切消化 ,得到 5′端截短的约 2 1kb增效蛋白基因片段 ,再与 pQE30质粒连接 ,构建了重组表达载体pQE/EnC ,转化大肠杆菌M15 (pREP4) ,在IPTG诱导下表达出分子量约为 78× 10 3 D的融合蛋白并命名为P78,纯化的P78包涵体显示了明显的增效活性 ,可提高AcMNPV对小菜蛾幼虫的感染率 2 7 88%～ 32 92 %。

昆虫病毒重组增效蛋白的广谱增效活性

室内生物测定表明 ,大肠杆菌表达的粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白P96可显著或极显著提高棉铃虫核型多角体病毒、苏云金杆菌和阿维菌素对棉铃虫幼虫的致死率 ,分别提高1 6 9.78%、73.90 %和 36 .0 4 % ;对苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒感染甜菜夜蛾幼虫也有明显增效作用。Na2 CO3 溶解的P96对棉铃虫初孵幼虫有一定致死作用。

重组增效蛋白对棉铃虫的弱化作用

为进一步拓展广谱高效生物增效剂——重组昆虫病毒增效蛋白P96的应用潜能,研究了P96对棉铃虫幼虫生长发育和成虫产卵量的影响效果.结果表明,与饲喂清水相比,棉铃虫幼虫取食P96后体重增长极显著减缓,发育延迟,累计化蛹达50%的时间推迟2.1～3.4d,蛹重减轻4.90%～5.21%,成虫产卵量减少52.62%～65.68%,P96对棉铃虫生长发育和繁殖有明显的弱化作用.

粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白的增效作用

采用时间 剂量 死亡率模型 ,分析了粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)颗粒体病毒重组增效蛋白P96对棉铃虫 (Helicoverpaarmigera)核型多角体病毒 (HaNPV)感染棉铃虫幼虫的增效作用。结果显示 :感染后 11d ,HaNPV +P96组的LC50 值为 3.4 7× 10 3 多角体 /mL ,比HaNPV组 ( 3.89× 10 4 多角体 /mL)降低了 91.0 8% ;在 1.6× 10 4 ～ 1.6× 10 6多角体 /mL浓度范围内 ,HaNPV +P96组的LT50 值较HaNPV组缩短 0 .3～ 1.8d。

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因克隆及在大肠杆菌中表达

用PCR技术从棉铃虫颗粒体病毒基因组中扩增得到增效蛋白基因DNA序列。PCR产物酶切后克隆至 pBluescript质粒中 ,核苷酸序列测定表明 ,有 8个核苷酸、5个氨基酸与Genbank发表的序列不同。继而构建了表达质粒 pET 30a En ,诱导后经SDS PAGE和West ernblot检测 ,表明获得了增效蛋白基因在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中包涵体形式的特异表达。生物测定结果表明 ,初步纯化的重组增效蛋白具有明显的增效活性 ,可提高棉铃虫核多角体病毒对 3龄幼虫致死率 31 7% - 34 1 %。重组增效蛋白的获得对研究其增效机理及构建新型杀虫剂提供了条件。

荧光增白剂与增效蛋白对美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)的增效作用

围食膜是昆虫中肠细胞与肠腔之间的一种防御性屏障,破坏围食膜即能促进病原微生物对昆虫的侵染。分别研究了荧光增白剂FB28和棉铃虫Helicoverpa armigera颗粒体病毒增效蛋白(En-Ha)对美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus,HcNPV)的增效作用,分析了活体条件下FB28与En-Ha对美国白蛾幼虫围食膜的破坏作用,解释了其增效作用机理。生物测定结果表明,FB28和En-Ha均能够影响围食膜蛋白的表达谱,提高HcNPV的感染率,使其毒力显著提高:单独饲喂HcNPV时的LC50值为1.11×105PIBs/mL,添加FB28和En-Ha后,其LC50值分别降低为1.91×103和7.70×103PIBs/mL,增效比值(SR)分别为58.12和14.42。SDS-PAGE电泳结果发现:用FB28饲喂处理幼虫后,分子质量为60 ku的蛋白条带消失,37 ku的新蛋白条带逐渐出现;幼虫摄取含有En-Ha的饲料后,分子质量为75 ku的蛋白条带消失,44.3 ku的新蛋白条带逐渐出现。经过10～24 h后,FB28和En-Ha处理的幼虫围食膜都能够恢复正常,表明其破坏作用是短暂的。

改进的小波多尺度频域增强算法

为提高图像识别在分类时的质量,必须在图像的预处理阶段对噪声进行滤除,对图像中的目标对象加以增强。从研究图像增强的频域法入手,研究小波多尺度灰度图像增强算法及小波边界延拓,设计了一种改进的小波图像增强算法及实现进程。在Visual C++软件平台上进行了仿真实验,仿真结果验证该算法能够提高对比度,有效显示淹没在阴影、光照等区域中的细节,在完成图像增强的同时,对噪声有较好的抑制作用。

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.6kb片段的表达

以棉铃虫颗粒体病毒 (Helicoverpaarmigeragranulosisvirus ,简称HaGV)基因组的DNA为模板设计引物 ,PCR扩增病毒增效蛋白 (Enhanicn)基因 ,然后经BamHI/PstI双酶切消化 ,得到近乎全长的约 2 .6kb的增效蛋白基因片段 ,再与pQE32质粒连接 ,构建了重组表达载体pQE32 /En ,转化大肠杆菌M15 (pREP4 ) ,在IPTG诱导下表达出分子量约为 10 2kD的融合蛋白并命名为P10 2 ,纯化的P10 2 包涵体显示了明显的增效活性 ,在感染后 16 8h时统计可提高HaNPV对棉铃虫幼虫的感染死亡率 6 .2 5 %～ 2 7.0 9% ,缩短LT50 12 .3h以上 ;在感染后 72h时统计可提高Bt对棉铃虫幼虫的感染死亡率 2 8.18% ,缩短LT50 12 .33h。

乳糖作为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达诱导剂的可行性研究

乳糖不仅可以诱导棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达,而且表达量与IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂时相比,并不低于后者,这样大规模生产棉龄虫颗粒体病毒增效蛋白的成本就可能被降低.乳糖的最适浓度经优化为2.2%～2.5%(W/V).对乳糖的不同除菌处理表明:0.70×105Pa 15min蒸汽灭菌的乳糖可以诱导此增效蛋白表达,这种处理比滤膜过滤除菌更为方便和经济,因此就为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白的生产提供了经济实用的前景.

转宿主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因的克隆表达及活性

以东方粘虫为转宿主增殖的颗粒体病毒(PuGV Ps)DNA为模板通过PCR反应扩增出一条2.7 kb的特异性基因片段,纯化的PCR产物克隆到载体质粒pET 15b中,构建重组质粒pET 15b En,重组质粒外源基因测序证明PCR扩增产物是粘虫颗粒体病毒转宿主病毒PuGV Ps增效蛋白的全长基因。与原始美洲粘虫颗粒体病毒(PuGV)增效蛋白基因的序列比较,两者同源性达99.59%。11个突变碱基中有7个集中在5′端下游500 bp,而3′端上游500 bp仅1个碱基发生突变。PuGV Ps增效蛋白基因重组质粒pET 15b En转化到大肠杆菌中构建重组菌,在IPTG诱导下表达了108 kD的表达产物,Ni2+柱纯化证明表达产物是目标增效蛋白。LB培养液中加入0.2%的葡萄糖后有利于增效蛋白基因的表达。生物测定结果表明,粗提的表达产物具有增效活性,可以提高Btδ内毒素对棉铃虫、甜菜夜蛾的敏感性。

粉纹夜蛾颗粒体病毒全长增效基因在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术扩增了粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)颗粒体病毒增效基因全长片段,扩增产物用EcoRⅠ/HindⅢ双酶消化,经0.7%低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化后插入pRSET-B中,得重组表达质粒pRSET/enhancin;但重组子生长异常,在IPTG诱导下未能明显表达目标蛋白.用PstⅠ/HindⅢ双酶消化pRSET/enhancin,电泳回收2.7kb片段后插入pQE-30中,得重组表达载体pQE/enhancin;在IPTG诱导下于35℃成功表达出分子量(Mr)约为108×103的融合蛋白并命名为P108.初步纯化的P108显示了极显著的增效活性,对棉铃虫核型多角体病毒感染棉铃虫3龄幼虫的7d致死率提高34.03%,LT50缩短1.4d;对苏云金杆菌杀棉铃虫3龄幼虫的72h致死率提高65.96%.

PuGV-Ps增效蛋白质基因特征及其整合载体的构建

为了明确增效蛋白质基因特性,获得重组增效苏云金杆菌,本试验通过生物信息学方法分析了转宿主东方粘虫颗粒体病毒（Pu GV-Ps）增效蛋白质基因（En）的特征及二级结构,利用In-fusion技术构建了整合载体。基于Pu GV-Ps增效蛋白质基因进化树显示,颗粒体病毒与多角体病毒为2个明显的分支,美洲粘虫颗粒体病毒（Pu GV）与转宿主东方粘虫颗粒体病毒的增效蛋白质基因遗传距离极小。6种颗粒体病毒增效蛋白质氨基酸序列比对结果显示,增效蛋白质N端相似性较高,均含有锌离子结构域（244位）与催化域（526～565位）;增效蛋白质基因二级结构中α螺旋和无规则卷曲占整个片段的73%,且N端以不规则卷曲为主;利用改进的In-fusion技术构建整合载体,双酶切结果显示增效蛋白质基因连接方向正确,p LTV1-En构建成功;通过高温整合获得重组工程菌Bt71En。表明,Pu GV-Ps与Pu GV增效蛋白质基因同源性较高,其二级结构复杂,影响载体构建,通过高温处理连接片段可以明显提高载体的连接效率。

杆状病毒杀虫剂增效途径研究进展

杆状病毒作为杀虫剂应用已成为生物防治中不可缺少的环节。但杆状病毒相对低的毒力和较长的杀虫时间是制约其推广应用的原因之一。本文就如何提高杆状病毒的杀虫效果 ,从基因重组、增效蛋白及化学增效剂三个方面 ,对近年来的相关研究进行了概括 ,并对三种增效途径在研究和应用中存在和面临的问题提出了解决对策。

文山松毛虫质型多角体病毒在Sf21细胞中离体增殖试验

研究了文山松毛虫质型多角体病毒 (DpCPV W )在Sf2 1细胞中的离体增殖行为 ,并进行了空斑试验 ,结果显示DpCPV W毒株能够在Sf2 1细胞中增殖 ,也能在Sf2 1细胞上形成空斑 ,并能产生形态正常的病毒多角体。在DpCPV W中加入基因工程增效蛋白 ,能显著增加病毒粒子对离体细胞的感染率 ,增幅达 145 %。生物测定表明 ,离体增殖的病毒多角体与虫体增殖的多角体的毒力相当。因此 ,Sf2 1细胞可以作为文山松毛虫CPV增殖行为研究的离体细胞系统 。