酶抑制剂及其构效优化在阿尔茨海默病中的应用

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,而临床上缺乏有效治疗AD的药物。近些年来研究发现,多种酶抑制剂如胆碱酯酶抑制剂、单胺氧化酶抑制剂、分泌酶抑制剂等能改善胆碱能系统的障碍、Aβ的产生和沉积、Tau蛋白的过度磷酸化、氧化应激损伤、突触可塑性下降等AD发生发展的不同环节,从而改善AD症状和认知功能。本文综述了近年来酶抑制剂或抑制剂构效优化靶向调节胆碱酯酶、单胺氧化酶、分泌酶等在AD治疗中的研究进展,以期为AD的治疗和药物研发提供新思路。

祖卡木颗粒对低氧性肺动脉高压的药效及机制研究

目的探究祖卡木颗粒对单纯低氧及低氧+Su5416诱导的低氧性肺动脉高压(HPH)小鼠的防治作用及其可能的作用机制。方法利用多种数据库及相关文献搜集祖卡木颗粒中10种单味药的活性成分,预测药物靶点并获得HPH相关靶点,进行网络构建及富集分析。通过单纯二周低氧及四周低氧+Su5416诱导建立HPH小鼠模型,观察小鼠右心室压力等主要药效学指标,Masson染色观察肺组织病理变化,Western blotting检测肺组织中Bcl-2-相关X蛋白质(Bcl-Associated X,Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、p-PI3K、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidase synthase,eNOS)、低氧诱导因子-1α亚基(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白表达水平。结果筛选得到祖卡木颗粒共167种活性成分,与HPH有179个交集靶点,涉及PIK3CA、HIF1等靶点。验证结果显示,祖卡木颗粒可以显著降低HPH小鼠的右心室压力,减轻右心室肥厚,下调小鼠肺组织中Bcl-2、HIF-1α蛋白的表达,上调Bax、PI3K、p-PI3K、eNOS蛋白的表达。结论祖卡木颗粒可能通过调节Bax/Bcl及PI3K-eNOS/HIF-1α信号通路对HPH起到防治作用。

棕榈酸降低内皮型一氧化氮合酶Ser633位点磷酸化水平对内皮细胞功能影响的分子机制

目的探讨棕榈酸(PA)降低内皮型一氧化氮合酶(eNOS)Ser633位点磷酸化水平对内皮细胞功能影响的分子机制。方法将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)随机分为Control组、PA处理组、FST预处理组、FST预处理+PA组、si-Control组、si-Control+PA组、si-PP2Ac组、si-PP4c组、si-PP2Ac+PA组、si-PP4c+PA组、Vector组、OE-PP4R2组、Vector+PA组、OE-PP4R2+PA组、NAC预处理组、APO预处理组、NAC预处理+PA组、APO预处理+PA组、si-gp91phox组及si-gp91phox+PA组,用Western blot检测eNOS总蛋白、eNOS Ser633磷酸化水平,蛋白磷酸酶2催化亚基(PP2Ac)、蛋白磷酸酶4催化亚基(PP4c)及其负性调节亚基(PP4R2)和NADPH氧化酶(Nox)催化亚基gp91phox蛋白表达水平;将HUVECs随机分为Control组、PA处理组、FST预处理组、FST预处理+PA组、Vector组、OE-PP4R2组、Vector+PA组及OE-PP4R2+PA组,用DAF-FM DA荧光探针检测细胞内NO含量;将HUVECs随机分为Control组、PA处理组、Vector组、OE-PP4R2组、Vector+PA组、OE-PP4R2+PA组,细胞划痕实验检测内皮细胞迁移能力;将HUVECs随机分为Control组、PA处理组、NAC预处理组及APO预处理组,DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量。结果PA诱导HUVECs内eNOS Ser633磷酸化水平降低呈时间依赖和浓度依赖方式(P<0.05),但对eNOS总蛋白表达水平无影响(P>0.05);PA下调PP4R2蛋白表达水平、上调gp91phox蛋白表达水平(P<0.05),但不影响PP4c蛋白表达水平(P>0.05);PP4抑制剂FST预处理可逆转PA诱导的eNOS Ser633磷酸化水平降低(P<0.05),恢复细胞内NO产量(P<0.05);敲低PP4c亚基可逆转PA诱导的eNOS Ser633磷酸化水平降低(P<0.05),而敲低PP2Ac亚基对eNOS Ser633磷酸化水平无影响(P>0.05);过表达PP4R2可使eNOS Ser633磷酸化水平升高(P<0.05),细胞内NO生成增加(P<0.05),内皮细胞的迁移能力增强(P<0.05);抗氧化剂NAC和APO预处理,细胞内ROS产量减少(P<0.05),PP4R2亚基蛋白表达增加(P<0.05),同时eNOS Ser633磷酸化水平增加(P<0.05);特异性siRNA敲低gp91phox亚基,可增加PP4R2亚基蛋白表达(P<0.05),提高eNOS Ser633磷酸化水平(P<0.05)。结论PA可通过Nox/ROS通路抑制PP4调节亚基PP4R2蛋白表达,激活PP4,进而降低eNOS Ser633磷酸化水平,细胞内NO产生减少,导致内皮功能障碍。

β-半乳糖苷酶及多聚半乳糖醛酸酶对桃果实成熟软化的影响

以雨花3号桃果实为试验材料,采用气相色谱法测定不同成熟时期桃果实的乙烯释放量以及ACC合成酶和ACC氧化酶活性的变化,并分析β-半乳糖苷酶(-βG al)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的变化,探讨-βG al和PG对桃果实成熟软化的影响。结果表明:在桃果实成熟软化过程中,具有明显的乙烯跃变高峰,ACC合成酶和ACC氧化酶活性变化趋势与乙烯变化相一致;PG活性高峰与乙烯释放高峰同时出现于成熟度Ⅳ,而-βG al活性高峰出现于成熟前期(即成熟度Ⅰ);-βG al不同于PG,其作用主要与桃果实成熟前期果实的软化启动密切相关。

一氧化氮处理对采后番木瓜果实乙烯生物合成的影响

为了解一氧化氮(NO)处理对番木瓜果实乙烯生物合成的影响,采用60μL/L NO熏蒸处理采收成熟度为果皮浅绿并微带黄色痕迹的番木瓜果实3 h,然后在20℃和相对湿度为85%条件下贮藏20 d。研究NO对番木瓜乙烯、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、丙二酰-1-氨基环丙烷-1-羧酸(MACC)、ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)及CpACS2和CpACO1基因表达的影响。结果表明,NO处理降低了番木瓜果实乙烯释放量、ACO的活性及CpACO1基因的表达,导致贮藏过程果实ACC和MACC的积累,但对ACS的活性及CpACS2基因的表达无显著抑制作用。

过度训练及补充二联甲苯或谷氨酰胺对大鼠腹膜巨噬细胞活性氧和诱导型一氧化氮合酶的影响

目的:观察过度训练及补充二联甲苯(DPI)或谷氨酰胺(Gln)对大鼠腹膜巨噬细胞活性氧(ROS)生成能力的影响,探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在此过程中发挥的作用。方法:8周龄健康雄性wistar大鼠56只,随机分为安静对照组(C)、过度训练组(E)、过度训练补充DPI组(ED)、过度训练补充Gln组(EG)。后3组根据取材时间不同各分为2组,运动后36h取材组(E1、ED1、EG1),运动后7天取材组(E2、ED2、EG2)。总计7组,每组8只,除C组外,其他6组都进行11周递增负荷跑台训练。断头处死大鼠并分离纯化腹膜巨噬细胞,流式细胞术测定ROS生成量,荧光定量PCR技术测定iNOS基因表达。结果:ROS生成:E1组显著低于C组;ED1组显著低于E1组(P<0.05),与C组相比极显著降低(P<0.01);EG1组与E1组相比没有显著差异,与C组相比极显著降低(P<0.01)。E2组、ED2组、EG2组分别与E1组、ED1组、EG1相比均显著增高;E2组、ED2组、EG2组、C组4组之间比较无显著差异。iNOSmRNA表达:ED1组相对E1组显著增加(P<0.05),相对C组极显著增加(P<0.01);ED2组相对ED1组显著降低;其他相关组间比较无显著差异。对各组中ROS与iNOS表达量进行相关分析,显示二者呈直线负相关,相关系数r=-0.45(P=0.004)。以各组ROS和iNOS表达量相对,C组的倍比关系作图,发现ROS生成量较高时,iNOSmRNA表达处于较低水平(E2组),随着iNOSmRNA表达水平增加,ROS生成量呈现降低趋势。结论:过度训练使腹膜巨噬细胞ROS生成量显著低于生理水平,引起运动性免疫抑制;补充抗氧化剂DPI可使过度训练时巨噬细胞ROS生成量进一步降低,补充谷氨酰胺对过度训练引起的巨噬细胞ROS生成量降低没有改善作用;过度训练及补充DPI或谷氨酰胺可影响巨噬细胞内ROS生成,这在一定程度上受iNOS催化产生的NO调控。

丙烯和1-MCP处理对采后柿果实ACS和ACO基因表达的影响

【目的】研究丙烯、1-甲基环丙烯(1-MCP)处理对采后柿果实中与乙烯合成相关的ACS、ACO基因特异表达的影响。【方法】以中国涩柿的优良品种‘富平尖柿’为试材,于初熟期采收后将果实分别用丙烯、1-MCP处理,在常温下贮藏,定期检测乙烯释放速率及分组织提取RNA进行Northern分析。【结果】丙烯处理促进ACS、ACO基因表达进而促进内源乙烯合成;1-MCP处理抑制ACS、ACO基因的表达从而抑制内源乙烯合成。不过,二者对ACS、ACO基因表达的作用效果在不同组织中差异较大:1-MCP处理对ACS、ACO基因表达的抑制作用在果皮中最明显,其次是果肉、果心部位,果蒂着生部位处最低;丙烯对ACS、ACO基因表达的促进作用表现为果肉、果心、果皮、果蒂着生部位递增。另外,ACS、ACO基因家族各成员在不同组织的表达也不同,DKACS3基因只在果蒂着生部位表达在其它组织中没有表达,DKACS2基因在丙烯处理果中的4个组织中均有表达。【结论】丙烯处理促进ACS、ACO基因表达,1-MCP处理抑制ACS、ACO基因的表达;ACS、ACO基因在不同组织中的表达差异较大;ACS、ACO基因家族各成员在不同组织中的表达也不同。

乙烯生物合成途径中的两个关键酶基因的研究进展

本文对植物激素乙烯生物合成途径中的两个关键酶基因即ACC合成酶基因(ACS)和ACC氧化酶基因(ACO)的克隆研究现状、表达及反馈调节等方面进行了评述。

筋脉通含药血清对高糖培养的Schwann细胞诱导型一氧化氮合酶和NADPH氧化酶p22-phox亚基表达的影响

目的:探讨筋脉通含药血清对高糖培养的Schwann细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)蛋白表达及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶p22-phox亚基mRNA表达的影响。方法:雄性Wistar大鼠随机分为3组,分别灌胃筋脉通、维生素C或蒸馏水制备含药血清和对照血清。取新出生大鼠的双侧坐骨神经用于制备Schwann细胞。将体外培养的Schwann细胞分为高糖组、筋脉通组(加入筋脉通含药血清)、维生素C组(加入维生素C含药血清)及正常对照组。培养48h后,采用免疫荧光法检测Schwann细胞内i NOS蛋白的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA的表达。结果:高糖培养的Schwann细胞内i NOS蛋白表达及NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA表达均较正常对照组明显升高(P<0.01);与高糖组比较,筋脉通组i NOS蛋白表达及NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA表达明显降低(P<0.01),且明显优于维生素C组(P<0.01)。结论:筋脉通含药血清可以下调高糖培养的Schwann细胞i NOS蛋白及NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA的表达。

抑制ACC合酶和ACC氧化酶对植物贮藏保鲜的影响

乙烯在植物成熟过程中起着重要的作用。ACC合酶和ACC氧化酶是植物乙烯生物合成的限速酶,在调节乙烯生物合成中起关键作用。本文从基因克隆及表达调控方面综述了ACC合酶和ACC氧化酶分子生物学研究进展,并介绍了抑制ACC合酶和ACC氧化酶对植物乙烯生物合成和花卉保鲜及果蔬贮藏的影响。

线粒体电子传递呼吸链及其生物学意义的研究进展

线粒体为细胞的生命活动提供基本能量。其内膜上的呼吸链酶传递氢和电子到ATP酶复合体,用于合成能量及维持跨内膜氢离子梯度循环。细胞生存所需能量的95%由线粒体呼吸链提供,主要由位于线粒体内膜上的5个复合体(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)组成的线粒体呼吸链酶完成,即NADPH-泛醌、琥珀酸-泛醌还原酶、泛醌-Cytc还原酶、细胞色素c氧化酶及ATP合成酶。本文对线粒体呼吸链Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ的分子结构、功能及生物学意义等进行了综述。

黄嘌呤氧化酶对血管内皮功能障碍的影响

目的考察黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)在自发性高血压大鼠(SHR)血管舒缩及内皮功能障碍中的作用。方法采用尾套法测定SHR和正常大鼠(WKY)血压;Greiss反应测定血清一氧化氮分泌量;FRAP(ferric reduction abilitypower)法测定主动脉蛋白总抗氧化能力;RT-PCR法考察黄嘌呤氧化酶及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表达情况;血管环舒缩测定来评价黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇(oxypurinol,Oxy)对大鼠腹主动脉内皮依赖性舒张反应的影响。结果SHR血压(191.1±5.6)显著高于WKY大鼠(140.4±5.9)mmHg;SHR血清NO分泌量(28.4±5.4)、主动脉蛋白总抗氧化能力(1.02±0.14)U/μg蛋白和腹主动脉内皮依赖性舒张反应(66.2±4.6)%均显著低于WKY[分别为(51.6±5.8),(2.8±0.3)U/μgpro和81.0%±2.7%);而心、肾及主动脉中黄嘌呤氧化酶表达均显著高于WKY大鼠(P<0.05)。黄嘌呤氧化酶抑制剂Oxy能明显降低黄嘌呤氧化酶mRNA表达(降低31.6%),且改善腹主动脉内皮依赖型舒张反应(提高20.2%),但对eNOS表达则无显著影响。结论结果提示SHR中存在内皮功能障碍和氧化应激状态,黄嘌呤氧化酶参与了SHR内皮功能障碍。

丹参酮ⅡA对帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元的保护作用及其机制

目的:探讨丹参酮ⅡA对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱发的帕金森病(PD)模型小鼠中脑黑质区多巴胺能神经元损伤的影响,阐明其对多巴胺能神经元的保护作用及其可能机制。方法:将60只C57BL/6N小鼠随机分为对照组、PD模型组和丹参酮ⅡA组,每组20只。PD模型组和丹参酮ⅡA小鼠采用MPTP制备PD小鼠模型,丹参酮ⅡA组制备PD模型后腹腔注射丹参酮ⅡA,观察各组小鼠行为学表现,采用免疫组织化学、免疫蛋白印迹和免疫荧光双标法检测各组小鼠中脑黑质区酪氨酸羟化酶(TH)、整合素超家族成员Ⅰ型跨膜蛋白(cd11b)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)阳性细胞数和蛋白表达水平。结果:与对照组比较,PD模型组小鼠出现典型的PD样症状;PD模型组小鼠中脑黑质区TH阳性神经元数和蛋白表达水平较对照组减少约45%和50%,cd11b、p47-phox和iNOS阳性细胞数和蛋白表达水平增加(P<0.01)。与PD模型组比较,丹参酮ⅡA组小鼠PD样症状减轻,黑质区TH阳性神经元数量和蛋白表达水平明显升高(P<0.01),cd11b、p47-phox和iNOS阳性细胞数明显减少(P<0.01),蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:丹参酮ⅡA可在一定程度上阻抑MPTP诱导的PD模型小鼠中脑黑质区多巴胺能神经元的丢失,其神经保护作用机制可能与抑制小胶质细胞激活、NADPH氧化酶和iNOS表达有关。

乙烯生物合成基因工程在果蔬保鲜中的应用

水果和蔬菜的成熟、衰老与乙烯密切相关。乙烯生物合成过程受到多种因素的综合调控。通过基因工程调节乙烯生物合成相关酶的含量或活性以阻断或减少果蔬中乙烯的产生,从而延缓果蔬成熟或衰老,是果蔬保鲜最重要的策略之一。多种果蔬ACC合成酶、ACC氧化酶与微生物ACC脱氨酶、SAM水解酶的基因已被克隆;采用基因工程调控这些酶基因在果蔬中的表达,可能延长果蔬的贮藏保鲜时间。乙烯生物合成基因工程在果蔬保鲜中具有良好的应用前景,少数耐贮藏转基因果蔬已经实现商品化生产。

乙烯生物合成及其控制研究进展

综述近年来对乙烯生物合成重要中间产物Ｓ腺苷甲硫氨酸（ＳＡＭ）及１氨基环丙烷１羧酸（ＡＣＣ）各种分流途径的研究进展，重点介绍参与这些途径的关键酶及其基因的特性，并对控制乙烯生物合成的基因工程作一总结。

农杆菌介导法将ACC合成酶和氧化酶反义基因转入日本甜柿的研究

以日本甜柿品种次郎(Diospyros kaki Thunb.cv.Jirou)的叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了次郎柿遗传转化体系。结果表明,菌液OD600值为0.6,乙酰丁香酮浓度为200mg·L-1,筛选培养3d,头孢霉素为300mg·L-1的转化率最高。在此条件下,将ACC合成酶和氧化酶的反义联合基因导入到次郎柿的组培苗中,经PCR检测,得到了8株转基因植株。

植物乙烯生物合成过程中活性氧的作用

大量的研究结果表明,活性氧参与植物乙烯生物合成过程具有明显的普遍性,超氧阴离子自由基是参与乙烯生物合成过程的主要活性氧。近年来研究的焦点主要从乙烯生物合成的关键调控酶ACC合酶及ACC氧化酶的酶活性、酶动力学特性、酶蛋白空间结构、酶基因表达水平等方面来阐明活性氧调控植物乙烯生物合成的机制。最新的研究表明:植物在各种正常或应激的生长条件下首先诱导了活性氧产生水平的变化,活性氧在基因或蛋白质水平上影响ACC合酶和ACC氧化酶的活性水平,从而调节乙烯的生物合成。本文首次综述了活性氧影响植物乙烯生物合成过程的最新研究进展,并对活性氧在植物乙烯生物合成中具有诱导与抑制并存的"双重性"作用进行了探讨。

芝麻素对自发性高血压大鼠的降压作用及机制

目的:观察芝麻素(Ses)对自发性高血压大鼠(SHR)的降压作用,并探讨其可能机制。方法:SHR 35只,随机分为SHR模型组、Ses160、80、40 mg/(kg·d)、卡托普利(Cap)30 mg/(kg·d),另设WKY正常对照组,于给药16周后,颈总动脉插管测收缩压(SBP)、舒张压(DBP)及平均血压(MBP),Griess Reagent法测主动脉中一氧化氮(NO)含量,化学比色法测主动脉中过氧化氢(H2O2)含量,RT-PCR观察主动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、p22phox及p47phoxmRNA表达。结果:与SHR组相比,Ses160、80 mg/kg组SBP、DBP、MAP均显著降低(P<0.01,P<0.05),主动脉中NO含量显著提高(P<0.01),eNOS mRNA表达显著增加(P<0.01,P<0.05),p22phox、p47phoxmRNA表达显著减少(P<0.01,P<0.05)。Ses各剂量组H2O2含量显著降低(P<0.01)。结论:芝麻素通过上调SHR主动脉中eNOS mRNA的表达,使内皮细胞合成和释放NO增多;下调主动脉NADPH氧化酶p22phox和p47phoxmRNA的表达,使NO活性恢复,发挥降血压的作用。

番茄果实采后冷激处理的生理研究

将绿熟樱桃番茄 (Lycopersicumesculentumvar.cerasiforme)果实采后冷激处理 ,然后贮藏在 (2 0± 1)℃条件下 ,以未经冷激处理的果实为对照 ,研究番茄果实成熟过程中的生理变化。结果表明 ,冷激处理后 ,ACC氧化酶 (ACO)和ACC合成酶 (ACS)的活性上升延缓 ,呼吸和乙烯跃变延迟 ,而叶绿素降解、番茄红素合成和果实的软化速率被抑制。

鬼臼多糖对免疫功能低下小鼠自由基产生酶活性的影响

采用环磷酰胺腹腔注射(50mg/kg)小鼠建立免疫抑制模型,观察鬼臼多糖(PEP)不同剂量(50,100,200mg/kg和400mg/kg)配合环磷酰胺应用后,对小鼠脾脏中黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)及一氧化氮合成酶(NOS)水平的影响。结果表明,PEP能显著降低免疫抑制小鼠脾脏XOD、MPO的活性;对脾脏总NOS活性无显著影响,但400mg/kg多糖可降低小鼠脾脏诱导型NOS活性,提示PEP可通过降低免疫抑制小鼠体内自由基产生酶水平而起到抗氧化作用。