一种副干酪乳杆菌快速鉴定方法的建立及应用

目的:基于肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR),寻找并制备一对引物探针,灵敏、准确地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。方法:寻找副干酪乳杆菌HP-B1145的肠杆菌基因间重复一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC)最佳反应体系,对ERIC片段回收纯化得到特定条带及序列结果,据此设计引物,快速鉴定副干酪乳杆菌。结果:根据回收得到的副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC片段,设计出了一对引物探针(1145-S-F:5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’;1145-S-R:5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’)。结论:根据引物特异性、准确性、普适性、含量限度实验得出,设计的引物能准确灵敏地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制研究

目的了解我院分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(PA)耐药机制及同源性分型情况。方法收集临床分离耐亚胺培南PA,用K-B法检测28株耐亚胺培南PA对12种抗菌药的敏感性,用肠杆菌科细菌基因间重复序列(ERIC)进行同源性分析,并用PCR法检测外膜孔蛋白OprD2和金属β内酰胺酶(IMP、VIM)基因。结果28株耐亚胺培南PA对其他12种抗菌药的耐药率在14.8%~42.3%。经ERIC-PCR分析后共有11个基因型。其中A型为11株:A1型9株,A2型2株;B型为5株:B1型2株,B2型2株,B3型1株;C型3株;D型2株;E^K型各1株。PCR检测到OprD2基因仅4株,其缺失率为85.7%,28株PA中检测到1株VIM基因,经测序证实为VIM-2型。结论本院耐亚胺培南PA的主要耐药机制为外膜孔蛋白缺失。在外科和高干病房中出现多种基因型的耐亚胺培南PA传播。

REP-PCR及ERIC-PCR法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析

目的:采用细菌基因外重复回文序列扩增(REP-PCR)和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)两种方法对副溶血性弧菌2株标准株,13株实验室保存菌株和73株分离菌株共88株进行分子分型。方法:通过REP和ERIC-PCR指纹图谱扩增,利用NTsys-pc软件采用Dice系数对指纹图谱进行聚类结果分析。结果:所有供试菌株可通过此两种方法进行分型得到清晰的指纹图谱,并反映出副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,REP-PCR扩增出5～9条分布在609～4200bp之间的条带,可将副溶血性弧菌分为5个群12类型,分辨指数达0.93,其中tdh+株在相似系数0.86时可聚类在第Ⅰ群;ERIC-PCR扩增出5～11条分布在400～7593bp之间的条带,将副溶血性弧菌分为7个群11个类型,分辨指数为0.94,其中tdh+株在相似系数0.76时可聚类在第Ⅰ群。结论:两种方法均显现出很好的分型能力,能够很好地将环境分离tdh+菌株和标准菌株聚类在一起,其中REP-PCR较ERIC-PCR重复性更好。

西安地区耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的碳青霉烯酶及同源性研究

目的调查西安地区耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的耐药性,研究其同源性及分子耐药机制。方法收集西安地区6所三级甲等医院1年间临床分离的非重复鲍曼不动杆菌株146株,采用K-B法进行药敏试验,E试验检测金属酶(MBL),PCR扩增OXA-23,-24,-58,-51like型及IMP-1型和VIM-2型碳青霉烯酶基因,其阳性产物经测序分析,应用肠杆菌科基因组内重复序列(ERIC)-PCR对菌株进行DNA分型和同源性分析。结果筛选出对亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌(IRAB)非重复株15株,其中1株经E试验检测产金属酶,但扩增blaIMP-1,blaVIM-2均阴性,另外14株扩增blaOXA-66均阳性,11株blaOXA-23阳性,1株blaOXA-58阳性;ERIC-PCR将15株IRAB分为A型和B型,其中部分菌株的亲缘关系很近,同源性达90%以上。结论产OXA型碳青霉烯酶是西安地区该菌对亚胺培南耐药的主要原因,其中OXA-23型普遍存在,OXA-58型和OXA-66型基因在国内尚属新型碳青霉烯酶基因型;15株IRAB为2种克隆型,可能存在局部暴发流行。

ERIC-PCR技术在鲍曼不动杆菌基因分型中的应用评估

目的了解仁济医院鲍曼不动杆菌的基因同源性,验证肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)-聚合酶链反应(PCR)在鲍曼不动杆菌基因分型中的实用性。方法采用琼脂稀释法检测临床分离的81株鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);采用ERIC-PCR对81株鲍曼不动杆菌进行基因分型;使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对其中的43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌进一步分型,以PFGE分型为参考标准,验证ERIC-PCR在基因分型中的实用性。结果 81株鲍曼不动杆菌对临床常用的13种抗菌药物普遍耐药,只对米诺环素耐药率最低,为30.9%,其次是亚胺培南,为53.1%,对其他抗菌药物的耐药率均>60%。81株鲍曼不动杆菌ERIC-PCR分型主要为A、B、C、D、E、F 6型,其中A、B、C型为主要的流行株。43株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌分型为A型41株(A1型29株,A2型12株)、B型1株、C型1株。PFGE分型将其分为5型,A型34株(A1型31株,A2型3株),B型6株,C、D、E分型各1株。结论仁济医院鲍曼不动杆菌存在克隆播散,且主要为耐亚胺培南鲍曼不动杆菌。ERIC-PCR分辨力较强,结果可靠,与PFGE结果具有一定的相关性,是一种简便、快捷的基因分型技术。

仔猪黄白痢大肠杆菌耐药性检测及ERIC图谱分析

以47株黄白痢临床分离大肠杆菌为材料，通过Kirby-Bauer法检测细菌耐药表型并用PCR扩增I型整合酶基因，进而对不同耐药谱菌株进行以肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应（ERIC-PCR）基因分型并用统计分析软件SPSS16，0聚类．耐药表型检测结果显示：47株大肠杆菌均呈多重耐药，共9种耐药表型；I型整合子阳性菌株检出率为95．7％（45／47）；ERIC-PCR扩增出现稳定可重复的基因指纹图谱，耐9～13种药物菌株（85．1％，40／47）的ERIC指纹图谱分别显示出2种主要谱型，各代表1个猪场的菌株类型．聚类分析提示，相同耐药谱的来自同一猪场和不同猪场分离株的平均相似率分别为68．7％和53．5％，显著高于47株菌的平均相似率37．3％．说明菌株耐药性可能与特定的ERIC指纹图谱相关，ERIC指纹图谱分析可作为考察猪源致病性大肠杆菌多重耐药表型与基因型特征的新视角．

溃疡性结肠炎肠道菌群结构ERIC-PCR指纹图谱分析

目的建立溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)与正常人的肠道细菌DNA指纹图谱,分析其肠道菌群的整体差异,并探讨UC患者肠道菌群的变化与疾病的发生、发展关系,为临床治疗UC提供理论依据。方法收集55例UC(30例活动期,25例缓解期)患者及15例正常人粪便标本,提取总基因组DNA,应用ERIC(enterobacterial repetitive intergenic consensus,肠道细菌基因间重复序列)-PCR技术建立各组肠道细菌DNA指纹图谱,运用UVP凝胶电泳分析软件统计分析活动期UC、缓解期UC及正常对照者肠道菌群的多样性和相似性。结果活动期UC患者肠道菌群结构多样性指数H3=2.2080,而缓解期UC和健康人肠道菌群结构多样性指数分别为2.7848、2.8080,且活动期UC菌群丰富度较其他两组低(P1,3<0.001,P2,3<0.001),而缓解期UC与正常对照组无明显区别(P1,2=0.542)。结论 UC活动期患者肠道菌群结构多样性较UC缓解期、健康人肠道菌群结构存在一定程度的差异。肠道菌群失调可能是UC发病的一个重要因素。

米醋沉淀中Bacillus subtilis DNA提取及ERIC-PCR体系条件优化

利用稀释平板法从米醋沉淀中分离获得细菌,通过对其进行16S rDNA分子鉴定,表明该细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。以该菌为实验材料,研究了细菌基因组DNA的提取方法,并将ERIC-PCR法首次应用于醋液菌种,对此反应体系的主要因素进行了优化,最终建立了适合于本实验室的ERIC-PCR体系。结果表明,采用改良的传统细菌基因组DNA提取方法,所提取的DNA质量较高,能够满足ERIC-PCR反应的需要;建立的反应体系为:25μL反应体积10×扩增缓冲液(含Mg2+)2.5μL,20pmol/μLERIC-PCR引物E11.0μL,20pmol/μLERIC-PCR引物E21.0μL,DNA模板2μL,2.5mmol/LdNTPs混合液1.6μL,taq聚合酶0.9μL,双蒸水补齐;PCR反应程序为:94℃变性4min,1个循环;94℃变性30s,58℃退火40s,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸4min。

快速提取肠道微生物基因组DNA的方法

目的:肠道微生物的研究日益成为热点,如何获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA是肠道微生物研究中的关键。本文通过对酚/氯仿法提取总DNA过程进行考察和优化,建立一种简便酚/氯仿抽提法。方法:考察和优化酚/氯仿法提取总DNA的过程,并根据DNA产量、纯度以及ERIC-PCR及16S rNDA-RFLP所反映的微生物群落结构特性的指标,并与QIAamp?DNA Stool Mini Kit提取的进行比较,评价了所建立的快速提取方法。结果:用简便酚/氯仿法得到基本完整的基因组DNA,ERIC-PCR和16S rDNA-RFLP结果与QIAamp?DNA Stool Mini Kit法基本相同。结论:该方法快速并成本低,适合肠道微生物研究中总DNA提取,尤其适合处理大批量的样品。

武汉市6起食物中毒副溶血弧菌分子特征研究

目的:了解武汉地区6起食物中毒病原菌副溶血弧菌分子特征。方法:对6起食物中毒共16株分离株进行药敏分析,运用PCR技术进行耐热性溶血毒素基因(tdh)和耐热性溶血毒素相关溶血素基因(trh)检测,并进行肠道细菌重复基因间共同序列PCR(ER IC-PCR)分析。结果:16株副溶血弧菌对第三代头孢和喹诺酮类较敏感,tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR结果显示每起食物中毒菌株亲缘关系非常紧密,有3起属于同一个群,另外2起属于一个群。结论:武汉地区流行的主要副溶血弧菌分子特征为tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR技术是分析副溶血弧菌引起食物中毒菌株非常有效的工具。

碳青霉烯类耐药大肠埃希菌耐药基因型检测及同源性分析

目的检测临床分离碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的耐药基因型,并对其同源性进行分析,研究其流行情况。方法收集铜陵市人民医院2012年9月至2016年10月临床分离碳青霉烯类耐药大肠埃希菌,采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪进行鉴定,改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型,EDTA双纸片协同试验进行金属酶初筛,聚合酶链反应(PCR)检测碳青霉烯酶基因(bla KPC、bla IMP、bla VIM、bla NDM和bla OXA-48),并对阳性扩增产物进行基因测序;同源性分析采用肠杆菌科基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(ERIC-PCR)。结果共收集碳青霉烯类耐药大肠埃希菌25株,8株改良Hodge试验阳性,13株金属酶初筛试验阳性,其中4株携带bla NDM-1基因,1株携带bla IMP-4基因,1株携带bla KPC-2基因;ERIC-PCR检测分为10种型别。结论碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的耐药机制主要是产金属酶,携带NDM-1型碳青霉烯酶大肠埃希菌需重点监测;碳青霉烯类耐药大肠埃希菌未在医院引起克隆流行。

青岛两所医院鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因及同源性分析

目的了解青岛市两所医院鲍曼不动杆菌(AB)耐药情况、分布特征,碳青霉烯酶基因携带情况。方法收集两所医院临床分离的145株(A院78株,B院67株)AB进行药敏试验,采用聚合酶链反应(PCR)扩增碳青霉烯酶基因,肠杆菌科基因间一致重复序列(ERIC)-PCR对菌株进行同源性分析。结果 A院AB对临床常用的16种抗菌药物普遍耐药,对头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(3.85%),其次是米诺环素(16.67%),对其他抗菌药物耐药率均>73%。B院AB对常用的23种抗菌药物普遍耐药,对米诺环素和替加环素均不耐药,对阿米卡星和左氧氟沙星的耐药率分别为23.88%、38.81%,对其他抗菌药物的耐药率均>64%。两院所有菌株均携带OXA-51基因,A、B两院碳青霉烯耐药组OXA-23基因的携带率分别为86.76%(59/68),56.67%(34/60),差异有统计学意义(χ2=14.53,P<0.001);A院3株菌携带OXA-58基因,B院未检出OXA-58基因。145菌株共分为8个基因型,其中A型71株和E型37株,为主要流行株;A院主要流行A型(46.15%)和E型(41.03%),B院主要流行A型(52.24%)和C型(17.91%)。结论两所医院临床分离的AB耐药情况严重,且存在医院流行,OXA型酶OXA-23、OXA-51基因在介导AB对碳青霉烯类药物耐药中发挥重要作用。

3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用评价

目的比较3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用。方法采用琼脂稀释法检测重症监护室（ICU）分离的30株鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度（MIC）;分别以肠杆菌科基因间重复一致性序列（ERIC）、基因外回文重复序列（REP）及随机多态性核苷酸序列（RAPD）为引物进行PCR扩增,利用电泳指纹图谱进行基因分型,并进行聚类分析。结果 30株鲍曼不动杆菌仅对头孢哌酮/舒巴坦有较低的耐药率;ERIC-PCR基因分型法的扩增条带最为丰富,能扩增出4∽7个条带,RAPD和REP-PCR扩增条带较少,分别扩增出1∽5和1∽4个条带;3种方法分别将30株鲍曼不动杆菌分为4、4、3个群。结论头孢哌酮/舒巴坦对于多重耐药鲍曼不动杆菌依然有较好的敏感性;本试验初步证实3种方法均可作为鲍曼不动杆菌基因分型的可选方法,ERIC-PCR较另外两种方法扩增条带更丰富,分辨率更好。

采用ERIC-PCR与PFGE分析鲍曼不动杆菌基因型和同源性并对比方法学差异

目的比较脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)与肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERICPCR)检测鲍曼不动杆菌同源性的结果差异。方法分别采用PFGE和ERIC-PCR对我院院内分离的43株鲍曼不动杆菌进行分型检测。结果 43株鲍曼不动杆菌通过PFGE分型得出:A型22株、B型10株、C型3株、D型4株、E型2株、F型1株、G型1株;通过ERIC-PCR得出7种型别:Ⅰ型22株、Ⅱ型10株、Ⅲ型3株、Ⅳ型2株、V型3株、Ⅵ型1株、Ⅶ型2株。2种方法结果相符率为76.8%。我院鲍曼不动杆菌存在克隆株传播。结论 ERIC-PCR操作简便、结果可靠,与PFGE结果一致性高,2种分型方法均适合作为医院进行病原菌流行病学调查的分型检测手段。

PCR指纹图谱技术在酸奶质量监测中的应用

用PCR指纹图谱技术对市售某品牌酸奶进行了短期动态监测,对于收集的3个生产批次的9个酸奶样品,用ERIC(EnterobacterialRepetitiveIntergenicConsensus,肠杆菌基因间保守重复序列)-PCR和PCR-DGGE(DenaturingGradientGelElectrophoresis,变性梯度凝胶电泳)指纹图谱技术对其菌种组成及其稳定性进行评价。ER-IC-PCR指纹图谱聚类分析结果显示,同一生产批次内3个不同包装的样品ERIC-PCR指纹图谱相似性为90%左右,而不同生产批次样品之间ERIC-PCR指纹图谱相似性有所下降,为82%。该结果进一步用DGGE指纹图谱进行证实。DGGE分析结果表明,G2样品明显缺少一条主带,经割胶回收测序发现,这条主带代表的微生物是Lacto-bacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus,说明该产品不同生产批次间的稳定性不是很好。DGGE图谱和测序结果还显示,除G2样品外,该酸奶样品的菌种组成与产品标签说明是一致的。

鸭疫里默氏杆菌ERIC-PCR基因分型

为了解广东地区鸭疫里默氏杆菌的流行情况,采用经优化建立的ERIC-PCR分型方法对来自广东地区16个鸭场的48株鸭疫里默氏杆菌分离株进行基因分型。结果表明:用ERIC-PCR法可将48个分离株分为16个基因型。12个鸭场存在着两种或两种以上基因型的菌株,并且不同鸭场流行基因型不同,8型和11型是较为流行的菌株。该研究结果可为广东地区鸭疫里默氏杆菌病的免疫防治提供参考。

副猪嗜血杆菌的分型技术研究进展

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)是猪的一种条件致病性病原菌。近年来世界各地副猪嗜血杆菌病的发生呈显著上升趋势,猪只感染后表现为多发性浆膜炎和关节炎,给养猪业造成巨大的经济损失。随着分子生物学技术的发展,用于副猪嗜血杆菌分型鉴定的方法亦越来越多。本文就目前国内外常用的技术方法作一综述,以期为该病的流行病学调查、兽医临床诊断与治疗提供参考。

碳青霉烯类非敏感肠杆菌科细菌分子流行病学研究

目的调查碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌的流行情况,并研究其耐药性传播方式。方法收集本院临床分离的碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌34株,用Vitek2 Compact系统进行细菌鉴定和常规药敏检测,改良Hodge试验筛选产碳青霉烯酶菌株,用肠杆菌基因间重复一致序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)-PCR进行分子流行病学调查。PCR扩增Int 1、Int 2、Int 3整合酶基因,质粒接合和消除试验研究细菌耐药基因的传播方式。结果 19株细菌改良Hodge试验阳性。来自7个不同科室的12株大肠埃希菌和17株阴沟肠杆菌可以分为3种和6种基因型,来自4个不同科室的5株肺炎克雷伯菌只有1种基因型。27株菌Int 1基因阳性,未检出Int 2和Int 3基因。除骨科1株阴沟肠杆菌外,其余33株细菌质粒消除和接合试验均成功。结论本院碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌主要发生在外科各科室;所有肺炎克雷伯菌和泌尿外科大肠埃希菌属同一基因型,表明此类菌株呈局部流行;碳青霉烯类抗生素非敏感肠杆菌科细菌耐药性主要通过质粒传播。

肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性分析及ERIC-PCR分型

目的：了解肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性情况以及各生产环节菌株间亲缘关系,为临床用药及菌株追踪溯源提供依据。方法：采用微量肉汤稀释法对171株肠炎沙门氏菌进行13种抗菌药物药敏实验;采用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR）法对33株不同生产环节耐药菌株进行分子分型;采用SPSS 20.0软件、Gel-Pro Analyer 4.0和NTSYS pc 2.1软件进行分析。结果：171株肠炎沙门氏菌对13种药物耐药情况不同,其中对氨苄西林耐药情况最严重,耐药率高达90.06%,对恩诺沙星、氧氟沙星最为敏感,耐药率均仅为5.26%;不同环节间耐药性差异极显著（P〈0.01）;多重耐药率高达95.32%,共有26种耐药谱型。不同环节的33株肠炎沙门氏菌分为4种（Ⅰ~Ⅳ）基因型,遗传相似性在66%~100%,Ⅰ型为优势基因型;基因型相同的菌株耐药谱不一定相同,反之,耐药谱相同的菌株基因型不一定相同。结论：肉鸡生产链条中沙门氏菌对多种抗菌药物产生耐药性,且耐药谱种类繁多;沙门氏菌能够沿着生产链进行水平传播,肉鸡场环节菌株基因型相对复杂,菌株基因型与耐药表型之间无明显相关性。